探索MALDI-TOF MS在肺炎克雷伯菌同源性分析中的应用*

张嘉文 吴森泉 周晓玲 陈惠霞 廖玉婷

南方医科大学附属东莞人民医院，广东省东莞市 523000

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KPN)是临床分离及医院感染的常见致病菌，根据2019年全国细菌耐药监测报告，它已位列全国前五[1]。由它引起的医院感染率呈现逐年上升的趋势，同时多重耐药菌株的出现往往容易造成患者的病程迁延，甚至导致临床抗菌药物治疗的失败[2]。因此，医院感染的及时发现、筛查和阻断传播途径，能有效降低病人治疗过程中的风险。目前基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(Matrix．assisted laser resolutionu ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)作为快速筛选菌株种属的新工具，具有高通量、时效高、误差小、性价比高等优势[3]，配合SARAMIS软件分析菌株间的相似性来分型，可用于同源性的分析比较。本研究应用MALDI-TOF MS对我院5个月内出现的医院感染KPN菌株进行同源性分析，以脉冲场凝胶电泳(PFGE)获得的结果作为参考，对MALDI-TOF MS方法进行评价；随后进一步采集5个月内所有KPN的质谱图数据，探索该技术在医院感染控制中作为初筛排查技术的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源：收集我院2020年9月—2021年1月临床分离的KPN非重复菌株218株，其中经过临床诊断符合医院感染22株菌。质控菌株：大肠埃希菌 ATCC8739，沙门氏菌标准菌株H9812。所有菌株均以-80℃保存。

1.1.2 仪器与试剂：DENSIMAT比浊仪、VITEK MS质谱仪、CHCA基质液、48孔靶板购自法国Bio-Merieux公司，血琼脂培养基购自郑州安图生物，CHEF系列电泳仪购自美国Bio-Rad Laboratories公司、PFGE电泳仪及成像仪源自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养：将菌株从-80℃冰箱取出，以分纯形式分批接种至哥伦比亚血琼脂平板上后，放入37℃温箱培养24h。先选取22株院感KPN菌株进行分纯培养，所得新鲜菌落将采用MALDI-TOF MS和PFGE分别分析同源性。然后对218株KPN菌株进行2次独立的MALDI-TOF MS重复实验，将菌株按48株/批进行分批分纯培养及上机实验。尽量保证每批次菌株的生长环境、培养时间、质谱仪操作时间接近，减少误差[3]。

1.2.2 MALDI-TOF MS分析同源性：挑单个菌落，采用直涂法[4]，置48孔靶板标本孔上，最后挑ATCC8739单一菌落，分别均匀涂抹在校准靶孔上，用于图谱校准。分别加1μl CHCA液覆盖靶孔上晾干，运用MALDI-TOF MS自带的RUO系统，选择线性、正离子模式，仪器状态为质荷比2 000～20 000Da，频率50Hz。将数据导入至SARAMIS Premium软件对目标菌株进行图谱分析。在Show Taxonomy界面，进行SuperSpectrum分析，根据聚类相似性系数，得到进化树分型。

1.2.3 PFGE分析：按照美国疾病控制与预防中心PulseNet 提供的 PFGE相关标准化操作程序，对22株医院感染菌株进行同源性分析[5]。经过胶块制备、细胞裂解、染色体DNA的酶切、加样和电泳、染色、脱色，最终获得成像。将PFGE图像录入BioNumerics软件，根据统一的分子质量标准进行校准，标定各图像条带的位置。分子量标准为H9812经过Xba I酶切后的片段。根据图像条带间的相似性系数，以非加权配对算术平均法构建聚类树[6]。

1.3 统计学方法 使用SPSS25.0统计软件进行数据处理分析，采用卡方检验比较MALDI-TOF MS和PFGE分析两种方法的关联性。使用列联系数衡量两者的关联程度，当P<0.05时认为有统计学意义。

2 结果

2.1 PFGE结果 22株院感KPN菌株经过PFGE聚类分析，得出同源性分析树状图，PFGE的分型见图1。根据PFGE结果，22株KPN可以分为A～D 4个聚类型，其中A、B细分1～2两个亚型，分别为A1(4株)、 A2(3株)、 B1(3株)、 B2(10株)、C(1株)、D(1株)。

图1 22株医院感染KPN的PFGE电泳图及同源性分析结果

2.2 MALDI-TOF MS结果

2.2.1 MALDI-TOF MS与PFGE对比分析：将22株医院感染KPN菌株的质谱数据，采用SARAMIS软件的相似性分型功能进行分析(见图2)。与PFGE检测结果对比，MALDI-TOF MS的结果为：(1)相似性介于98%～100%的菌株有11株，为PFGE-A型3株(含A2型2株，占66.7%)和B型8株(含B2型7株，占87.5%)；(2)相似性介于94%～98%的菌株有7株，为PFGE-B型5株和A2型、C型各1株；(3)相似性介于90%～94%的菌株有3株，均为PFGE-A1型；(4)相似性<90%的为D型(1株)；见表1。经χ2检测，χ2=41.343，P=0.000，列联系数=0.808。可认为两种同源性分析方法间有关联，且具有统计学意义；同时，列联系数越接近1，则认为两者的关联性越高。

图2 22株医院感染KPN的MALDI-TOF MS相似性分型结果

表1 MALDI-TOF MS与PFGE的同源分析结果比较

2.2.2 MALDI-TOF MS 临床标本初筛情况：对218株KPN共进行了3次MALDI-TOF MS检测实验。第1次同源性分析数据是临床分离鉴定时获得的蛋白质量指纹图；而第2次、第3次的数据是菌株在同一复苏环境和培养时间下，分别进行的2次独立重复实验所获得的蛋白质量指纹图。3次同源性分析结果显示，相似性>90%的菌株数分别为77、69、71。出现2次或以上结果一致的菌株有28株，其中包含所有医院感染菌株(共22株)。

3 讨论

近年来，医院感染问题已引起医学界的广泛关注，它的出现会增加病人的痛苦，延长病人的住院时间，增加病人和国家的经济负担；影响医院的正常诊疗、增加治疗的风险[7]。而流行病学调查是预防和阻断院内感染传播、暴发的最有效手段。当院内出现疑似病例时，常采用同源性分析方法来追踪病原体。

现今，PFGE技术是同源性分析的金标准[8]，它具有较高的精确度和稳定性，但由于操作较烦琐、耗时长、费用高等缺点，难以被普通医院作为常规技术开展使用。最近MALDI-TOF MS作为一种快速鉴定病原菌种属的新技术在广大医院逐渐得到普及[3，9]，它能通过分析菌株间蛋白丰度的相似程度，从而快速获得细菌同源性。张杰、王媛媛、李鑫等[9-11]多个国内研究团队已证实MALDI-TOF MS技术可应用于碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的同源性分析。但该类菌只是日常临床分离细菌的极少一部分，而且国内应用MALDI-TOF MS技术进行大样本的检测实验较少[12]。本研究通过与PFGE技术做对比，探索MALDI-TOF MS应用在KPN同源性分析中的可行性；另一方面通过大样本检测，评估该技术作为监测医院感染KPN初筛方法的应用价值。目的为医院感染管理找到可靠、快速、高通量的初筛菌株方法，从而更好地服务临床，尽早发现医院感染，有效预防细菌传播和暴发。

根据MALDI-TOF MS 与PFGE 检测结果的对比分析显示，除274号标本的PFGE结果无法出现清晰条带外，其余21株医院感染菌株MALDI-TOF MS相似性均>90%。可认为相似性>90%的菌株为高度同源性菌株，该结论与张杰、李鑫等[9，11]的研究结论一致。本研究中，医院感染菌株的MALDI-TOF MS相似性分别在90%～94%、94%～98%、98%～100%间出现菌株高度集中，可将菌株分为3组：相似性为90%～94%的菌株均为PFGE-A1型；相似性为94%～98%的菌株主要以PFGE-B型为主(71.4%)，但不能区分B1、B2两种亚型；相似性为98%～100%的菌株主要以PFGE-B2型为主(63.6%)。MALDI-TOF MS与PFGE的结果经医学统计学的卡方检验分析后，获得P<0.000，列联系数为0.808。列联系数在χ2统计中为相关性测量值，值的范围在0～1，而且越接近1的值表示变量之间的相关度越高。因此，可认为两种同源性分析方法间有关联，且具有统计学意义。即MALDI-TOF MS技术可作为医院感染KPN同源性分析的快速检测方法，能较好反映医院感染菌株的流行趋势。

然而MALDI-TOF MS技术仍存在部分弊端。在本研究中，PFGE-A2与B2亚型菌株的MALDI-TOF MS相似性均为100%，出现相同的检测结果，由此，表明MALDI-TOF MS技术的特异性不足，无法明确区分菌株的亚型。因此，在MALDI-TOF MS技术的临床应用中，经筛查得出高度怀疑的医院感染菌株，应引起重视，必要时采用PFGE方法进行确认。检测部门在做好预防医院感染暴发的同时，也要防止结果的误报[13]。

此外，本研究采用MALDI-TOF MS技术进行大样本的检测实验，对218株临床分离KPN进行重复检测实验。根据前文的实验结论，将MALDI-TOF MS相似性>90%的菌株纳入高度同源组。在3次重复实验中，检测获得高度同源组的菌株数量相差较少，有28株菌株出现2次或以上结果一致，其中包含了被临床确诊为医院感染的22株KPN。在屈晨虹、陈峰、田月如等[3-4，12]研究团队指出，MALDI-TOF MS的检测结果易受客观因素影响，如菌株的培养条件、前处理操作方法等等。而本研究在尽量保证菌株的培养条件一致的情况下，使用相同的操作方法进修重复实验，结果表明MALDI-TOF MS技术具有较好的实验重复性。本研究结论认为，MALDI-TOF MS在临床应用中可作为初筛技术对临床分离KPN进行逐级筛查。首次的MALDI-TOF MS实验可获得约35.3%(77/218)的高度同源组菌株；再次，对高度同源组菌株进行第2、3次重复实验，出现2次或以上结果一致的菌株便可认为是高度怀疑的医院感染菌株；随后，结合临床诊断及其他方法学技术对高度怀疑菌株进行进一步筛查及确诊。

综上所述，MALDI-TOF MS技术具有快速、高通量、实验重复性较好的特点，与PFGE技术的菌株分类基本一致，可作为医院感染控制的初筛排查技术，在一定程度上能快速追根溯源，增强院内病原菌流行防控的时效性。但其实验的特异性仍存在不足，单次的检测结果可能出现疏漏，仍需结合临床诊断和更准确的同源性分析技术明确流行规律，从而采取适当措施，严格控制医院感染的进一步暴发。MALDI-TOF MS作为新技术广泛应用于其他临床菌株的同源性分析，仍需更深入的实验研究。