宏基因组二代测序在非HIV感染型肺孢子菌肺炎中的应用研究*

陈佳怡，梁 晓，夏铵冬，杨 芸，袁 兵，耿嘉蔚△

(云南省第一人民医院/昆明理工大学附属医院:1.感染性疾病及肝病科;2.呼吸与危重症医学科，昆明 650032)

肺孢子菌肺炎(PJP)是由耶氏肺孢子菌(Pj)感染引起的疾病，常见于艾滋病患者和其他免疫机能低下宿主。近年来随着免疫抑制药物的使用，非HIV感染者的PJP越来越引发关注。既往经验来看，非HIV感染PJP患者往往比HIV感染者发病更急、疾病进展更快、重症化概率和死亡率更高[1-2]，因此早期诊断尤为重要。在现有临床Pj检测手段中，特殊染色镜检的病原检出率低，免疫组织化学和PCR等[3]在多数临床机构中应用有限。近年来，随着基因测序技术的发展，宏基因组二代测序(mNGS)在病原学诊断中有越来越多的实践，多用于特殊、罕见感染的鉴定和新发病原体的解析。本研究报道mNGS辅助诊断非HIV感染型PJP患者情况，结合既往研究阐述mNGS在非HIV感染型PJP病原学诊断中的价值和特点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2019年4月至2021年1月在本院住院并通过mNGS结合临床资料诊断PJP的18例患者。入组标准：>18岁；具有免疫受损疾病基础[4](3个月内有血液系统或实体恶性肿瘤化疗史，自身免疫性疾病、器官移植等疾病史及接受糖皮质激素或其他免疫抑制药物治疗>30 d的用药史，其他免疫功能低下状态)；肺炎伴呼吸困难、低氧血症或呼吸衰竭表现；胸部CT提示弥漫型或斑片状融合型磨玻璃影(GGO)、小叶间隔增厚网格影等间质性病变征象；伴或不伴G试验、乳酸脱氢酶(LDH)等血清学检测结果支持；外周血或呼吸道标本mNGS检出Pj序列；排除HIV感染。本研究通过本院伦理委员会批准(KHLL2022-KY013)。

1.2 方法

1.2.1临床资料收集

从住院电子病历系统中收集入选病例的一般资料，包括性别、年龄、入院时间等，以及发病时间、临床表现、实验室检查、影像学检查、合并症、传统呼吸道标本病原检测结果(涂片+培养等)、二代测序结果、治疗及转归等临床资料。抗Pj治疗2周以上进行疗效判断，好转表现为临床症状及生化指标改善，肺CT病灶较前吸收好转；记录患者院内死亡情况。

1.2.2mNGS检测

按照采样标准流程采集支气管肺泡灌洗液(BALF) 5 mL或血标本3 mL放置 4 ℃冷藏，并于24 h内专人低温运送至第三方测序中心(华大基因科技有限公司)。测序平台使用BGISEQ-500进行测序。数据分析：测序数据下机后去除低质量和长度<35 bp的数据。通过BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)比对，将人源基因组序列数据去除，再去除低复杂度序列数后与专用微生物大数据库(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)比对，按照细菌、真菌、病毒、分枝杆菌和寄生虫等进行分类和排列。

1.3 统计学处理

采用SPSS25.0统计软件进行分析。计数资料以例数或率表示。计量资料以M(P25,P75)表示，两两比较采用 Mann-WhitneyU检验；测序参数与临床数据进行Spearman秩相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基本信息

18例患者中男15例，女3例，中位年龄46岁。所有患者均有肿瘤、肾病或自身免疫性疾病背景，见表1。其中16例患者使用激素+免疫抑制剂治疗基础疾病，使用时间10.5(4.0，24.0)个月，另外2例为正在接受化疗的恶性肿瘤患者。

表1 18例患者入院时的一般情况及实验室检查

续表1 18例患者入院时的一般情况及实验室检查

2.2 临床资料

患者以急性、亚急性起病，从起病至mNGS标本采集的中位时间为16 d，最短4 d。起病症状以发热(77.8%)、咳嗽(100.0%)、干咳(50.0%)、气促(77.8%)为主。所有患者入院时均有不同程度的低氧血症，氧合指数(校正大气压后)262(215,297)，LDH水平473.0(303.5,581.3)U/L。15例患者的血清1，3-β-D葡聚糖276.0(178.9,569.8)pg/mL，15例患者的诱导痰细胞中性粒细胞比例明显升高达73.08%～97.02%，提示肺炎症损伤重。所有患者入院72 h内均进行了细胞免疫功能评估并记录 CD4+T淋巴细胞计数，其中8例<200个/μL。18例患者均采集呼吸道标本送院内涂片及培养，2号病例痰培养出敏感嗜麦芽窄食单胞菌，7、11、13号病例痰涂片查见真菌孢子和(或)菌丝，但因实验室条件有限未进一步鉴定，其余均为阴性。影像学上病例均呈现双肺弥漫性或斑片融合型磨玻璃征，部分可见小叶间隔增厚、网格影、铺路石征等。

2.3 mNGS结果

测序标本在入院后7～10 d采集，测序结果均于第三方测序中心收到标本约48 h后回报，标本检出Pj菌种严格比对的序列数为14～10 579个，除1例外其余标本的Pj序列相对丰度在85%以上(图1)，Pj序列数在所有检出微生物种间排名1～14名(图2)。不同个体之间的Pj序列数差异较大，与 PJP 的发病时间、氧合指数、CD4+T淋巴细胞计数无明显相关性(rs=-0.131、-0.129、-0.040，P>0.05)，见表2。Pj序列数在采样前是否经验性抗Pj治疗(P=0.158)及是否发生院内死亡(P=0.426)的组间比较中也无明显差异。其他微生物检出情况：14例患者标本检出病毒序列，其中，9例检出人类β疱疹病毒5型(CMV)序列，6例检出人类γ疱疹病毒4型(EBV)序列，2例检出了单纯疱疹病毒(HSV1)序列，1例血标本检出了细环病毒属序列。所有BALF标本都检出大量细菌序列并报告了可疑致病菌，其中2号病例检出军团菌属，3号病例检出李斯特菌、铜绿假单胞菌；2例血标本并未检出细菌序列。

图1 18例标本Pj序列数及相对丰度

图2 18例标本Pj序列数在微生物序列中的种间排名

2.4 治疗反应及预后

所有患者在采样前均接受抗菌药物治疗，其中4例患者经验性使用磺胺甲噁唑/甲氧苄啶或棘白菌素类抗Pj治疗，其余患者在mNGS结果回报后加用上述药物抗Pj治疗，部分患者胸部CT特征见图3。最终3例患者因脓毒症多器官衰竭而发生院内死亡，其余患者均好转出院随访。

表2 Pj序列数与部分临床指标的相关性分析

A：2号、4号、12号、15号、16号、18号病例PJP特征表现主要为双肺弥漫性磨玻璃影，可见网格影和铺路石征(箭头)等；B：20号病例抗Pj治疗后病灶吸收；C：8号病例从起病局部磨玻璃影(2020-01-23)进展为双肺弥漫性病变(2020-02-22)，最后抗Pj治疗好转(2020-03-06)。

3 讨 论

PJP是免疫抑制宿主常见的严重机会性感染疾病，在国内外的报道中，PJP的发病率在侵袭性真菌感染疾病中排名前4[5-6]。早期诊断对PJP患者的预后有重要意义[7]，然而既往临床实践中直接获得PJP病原学证据较为困难，新兴的mNGS技术具有高灵敏度、覆盖广、无偏倚的特点，给感染病诊断带来更多的病原信息，且抗菌药物使用对mNGS的影响小于传统培养[8]，因此临床上得以实践应用。

本研究中主要检测PJP患者的下呼吸道标本，尽管Pj也可以在人类Ⅰ型肺泡上皮细胞表面定植生长[9]，但免疫正常和免疫抑制人群中的呼吸道病原谱仍有明显差异。WU等[10]分析了多中心329例重症肺炎BALF标本的mNGS，Pj序列均在免疫受损的肺炎病例中检出，而免疫功能正常的264例病例中并未检出，既往大样本呼吸道标本mNGS研究中Pj序列检出率也并不高[8]，提示免疫受损人群的Pj阳性结果有较大意义。此外，有研究观察到非HIV型PJP BALF中的Pj载量明显低于HIV型PJP[11]，因此虽然部分标本仅检出少量Pj序列，本研究仍然将此作为支持诊断的重要依据。

除呼吸道标本外，血液 mNGS在PJP诊断中也有良好的敏感性，且一般不受呼吸道定植菌的干扰。在顾鹏等[12]研究中，外周血mNGS对肾脏病合并PJP的诊断灵敏度和特异度达到了94.59%和100%。另一项研究分析了14例肾移植术后的PJP患者，92.8%的患者均通过外周血或呼吸道标本mNGS发现Pj序列，且与PCR验证结果一致[13]，值得注意的是，在该研究中呼吸道标本匹配到的Pj序列数(488～29 751)明显高于血标本(6～260)，并且在2例患者的4份同源同期标本中得到验证，提示呼吸道标本可能有更高的检测效能。

此外，非HIV型PJP患者常为免疫机能受损的重症患者，往往非单一病原体感染。在本研究中，BALF测序都报告了可疑致病菌序列，部分检测出非典型细菌病原体，如军团菌属、李斯特菌等，给治疗用药提供了参考。而2例血标本测序虽然没有报告细菌序列，但患者的临床资料均有细菌性肺炎的表现，如咳黄痰、中性粒细胞升高及影像学实变征等，入院后给予经验性抗菌药物治疗。既往PJP研究中血mNGS的细菌检出率也仅有21.6%[12]，在另一项重症肺炎(SCAP)的诊断研究中，以血培养为金标准，外周血mNGS的敏感性和一致率均不如呼吸道标本[14]，提示呼吸道标本对非HIV型PJP的诊疗更有优势。

目前对于判断mNGS检出序列为致病菌尚无定量标准，有研究提出Pj序列的相对丰度>85%或序列数排名前15名可能提供较满意的诊断阈值[15]。在本研究中，17例标本中Pj序列相对丰度>85%，包括2例血标本。也有研究观察到血标本中Pj序列相对丰度差异较大分布离散[12]，由于均为小样本观察性研究，还需要更多前瞻性研究来进一步验证。此外，测序结果不能单一解读，共识建议[16]若mNGS结果符合患者的临床表现和其他实验室检查，可以根据结果指导临床决策。

本组病例的诱导痰细胞分类发现中性粒细胞明显升高，且入院时均有不同程度的低氧血症或呼吸衰竭，提示患者肺炎症损伤重。有研究对比了HIV型PJP患者的BALF细胞分类，在非HIV患者中观察到更高的中性粒细胞计数，间接提示非 HIV型PJP有更严重的肺损伤[11]。影像学上，PJP典型的CT特征为双肺散在斑片样或弥漫性磨玻璃影、小叶间隔增厚，但不具有特异性。血清G试验可以辅助诊断PJP，但需要和其他真菌如念珠菌属、镰刀菌属、曲霉菌属等感染相鉴别。有研究认为下呼吸道标本PCR结合G试验可以有效地区分PJP定植和感染[17-18]，但G试验最佳诊断阈值各不相同，需要进一步验证。此外，mNGS指导抗菌药物调整后的治疗反应也可以作为依据。本研究不足之处在于缺乏特殊染色等验证试验，还有部分患者随访不足，未能观察到疾病的远期变化，未来需要前瞻性研究设计来改进。

综上所述，在非HIV感染型PJP的诊断中，BALF和血标本mNGS均有较好的灵敏度。非HIV型PJP往往呈现重症化和混合感染的趋势，条件允许时仍建议优选下呼吸道标本如BALF送检，以获得更全面的病原学信息。此外，Pj序列的相对丰度对致病菌的判定可能有提示作用，Pj序列数与临床指标及预后无明显相关，但需要前瞻性更大样本研究来验证。mNGS的结果需要综合其他临床资料综合判断。