基于线粒体NADH1基因对棘胸蛙养殖群体的遗传多样性分析

章海鑫，丁国栋，吴子君，习宏斌，史小元，张燕萍*

(1.江西省水产科学研究所，江西 南昌 330039；2.峡江县农业农村局，江西 吉安 331400)

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)，俗称石蛙[1]。棘胸蛙是蛙类的主导养殖品种中价格最高的种类之一，棘胸蛙在长期的养殖过程中由于近亲繁育，出现个体小、体质弱、畸形的现象，种质有所衰退，其生长速度慢。急需对养殖群体开展遗传多样性分析。

NADH1脱氢酶亚基Ⅰ是一种位于线粒体内膜催化电子从NADH传递给辅酶Q的酶[2]，基因变异大、进化速率快，其作为分子标记已在多头带绦虫、猎豹线、四川黑熊、文昌鱼等物种鉴定和分子进化分析等方面应用广泛[2-5]。

本研究应用线粒体NADH1脱氢酶亚基Ⅰ作为分子标记，对江西省内5个棘胸蛙养殖群体的遗传结构和变异进行了比较分析，了解群体之间的遗传分化和种群历史动态，为我省棘胸蛙的品种选育与改良工作提供理论基础，为保护并合理开发利用棘胸蛙种质资源提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 棘胸蛙样品采集

138只棘胸蛙样本分别采自峡江(XJ，21尾)、明月山(MY，30尾)、靖安(JA，32尾)、于都(YD，25尾)、金溪(JX，30尾)。采样地点详见图1。剪取适量腿部新鲜肌肉用95%乙醇保存，运回实验室，- 20 ℃冷冻保存备用。

图1 棘胸蛙采样图

1.2 实验方法

1.2.1 基因组 DNA 的制备

取少量棘胸蛙的肌肉，按照生工生物工程(上海)有限公司提供的动物基因组提取试剂盒说明书提取基因组DNA，核酸蛋白检测仪测定溶度后，-20℃冷冻保存备用。

1.2.2 PCR扩增

根据Genbank 数据库中棘胸蛙的线粒体基因组(Genbank NC_013270.1 )，采用Primer 5.0软件设计扩增2对NADH1 基因的引物，送至生工生物工程(上海)有限公司合成，具体引物序列信息见表1。PCR 扩增体系的总体积为50 μL，其中10 mM MgCl25 μL、 10 mM dNTPs 2 μL、10 mM引物各 2 μL，模板DNA(50 ng /L)4 μL，Taq 聚合酶0.4 μL，加超纯水至50 μL。PCR反应程序：95 ℃变性 40 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s ，35个循环；72 ℃ 延伸 10 min，4 ℃保存。

表1 棘胸蛙NADH1基因扩增引物信息

1.2.3 PCR产物检测和测序

PCR产物取5 μL用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的长度和浓度合格后，将PCR产物送往生工生物工程(上海)有限公司纯化与双向测序，测序引物同上。

1.3 数据分析

将获得棘胸蛙NADH1的基因序列应用DNAMAN软件进行拼接并手工校对。Clustal W(1.83)软件[6]分析比对；利用DNAsp 5.0[7]软件统计单倍型及变异位点(S)、计算单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(Pi)、平均核苷酸差异数(K)等多样性参数。用MEGA 6.0 软件[8]中的 Kimura 双参数法计算各单倍型间的遗传距离；采用邻接法NJ(Neighbor-joining)，Bootstrap 置信值估算重复次数 1000 次，对基因序列数据进行系统分析。用Ariequin 3.11[9]软件进行 Tajima's D 和 Fu's Fs 中性检验，计算群体内和群体间的遗传分化指数(Fst)，并通过分子方差分析(analysis of molecular variance，AMOVA)对遗传变异进行分析。

2 结果与分析

2.1 棘胸蛙NADH1基因序列PCR 扩增

PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测，棘胸蛙NADH1序列条带电泳图谱条带清晰、明亮，线粒体NADH1序的片段大于1000 bp。这可说明提取的棘胸蛙肌肉DNA 质量较高，能够用于后期的群体遗传学研究。

2.2 棘胸蛙线粒体NDAH 1序列特征

序列经比对后，获得的棘胸蛙样品的线粒体NDAH1序列长度为1187 bp，未检测到插入和缺失位点，检测到变异位点105个，其中简约信息位点96个，单突变位点5个(图2)。碱基平均含量：A (28.3%)、T(30.1%)、G(13.6%)和 C(28.1%)，A + T 含量(58.3%)高于 G + C 含量(41.7%)，与大多数脊椎动物线粒体DNA序列特征基本一致。

图2 棘胸蛙养殖群体单倍型线粒体NADH1基因的变异位点图

图3 5个棘胸蛙养殖群体线粒体NADH1序列的核苷酸不配对分布

2.3 单倍型分析

基于5个棘胸蛙养殖群体138条NADH1序列，共界定出41种单倍型，各单倍型分布情况见表2。其中Hap_13和Hap_5出现频率最高，由峡江、明月山、于都以及金溪4个群体共享。5个群体中，于都群体分布的单倍型最多(13种)、金溪群体分布的单倍型最少(10种)。Hap_1、Hap_6、Hap_8、Hap_11为峡江群体的特有单倍型；Hap_14、Hap_15、Hap_21、Hap_26、Hap_28为明月山群体特有单倍型；Hap_17～Hap_20、Hap_22、Hap_24、Hap_25、Hap_27、Hap_29为于都群体特有单倍型；Hap_30～Hap_38为靖安群体的特有单倍型；Hap_39～Hap_41为金溪群体的特有单倍型。

表2 棘胸蛙单倍型在群体中的分布

2.3 遗传多样性分析

群体内的遗传多样性可以通过单倍型多样性、核苷酸多样性和平均核苷酸差异数等数据来体现。通过DnaSP 5.0软件对本研究中江西省5个棘胸蛙养殖群体138条NADH1 序列进行核苷酸多态性分析，结果见表3。138个样本总体单倍型多态性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)分别为0.956±0.007和0.0232±0.00156。从总体上来看，单倍型多态性高则核苷酸多态性也较高，成正比关系。平均核苷酸差异数(K)为27.514，各群体平均核苷酸差异数在3.326～32.987。

表3 棘胸蛙群体的遗传多样性参数

2.4 遗传结构

通过利用MEGA 6.0软件中的Kimura 2-parameter模型，计算出5个棘胸蛙群体之间以及群体内部的遗传距离(D)，结果如表4所示。5个棘胸蛙养殖群体内的遗传距离在0.003～0.034之间分布，群体间的遗传距离为0.024～0.035，平均遗传距离为0.031。在5个养殖群体中，遗传距离最近的为XJ与MY、XJ与JX、MY与JX，遗传距离最远的为XJ与JA。

表4 江西棘胸蛙养殖群体间遗传距离(对角线下)、群体内遗传距离(对角线)和遗传分化系数FST值(对角线上)

2.5 遗传差异及遗传分化

遗传分化指数FST值是反映各群体间遗传分化程度高低的重要指标。通过运用Arequin 3.5软件计算5个棘胸蛙养殖群体的遗传分化，结果见表4。结果表明棘胸蛙两两群体间遗传分化系数(FST)值在0.03594～0.55798之间，峡江群体(XJ)与于都群体(YD)间遗传分化很小(00.25，P<0.001)[10]。

利用AMOVA软件进行棘胸蛙群体间和群体内的遗传变异分析，分析结果如表5所示。结果显示群体间的变异为36.94%，群体内的变异为63.06%，群体内的变异明显大于群体间的变异，表明遗传变异主要来自棘胸蛙群体内部。

表5 棘胸蛙养殖群体间分子变异分析(AMOVA)

2.6 单倍型系统进化树

基于NADH1基因序列的棘胸蛙群体的单倍型数据，构建NJ系统发育树，见图4。从构建的自展值50%可知，41种单倍型分成3个分支，自展值为99%。

图4 5个棘胸蛙养殖群体单倍型的NJ系统发育

2.7 种群历时动态分析

利用Ailequin 3.11软件对江西省5个棘胸蛙养殖群体进行Tajima'sD与Fu'sFs检验，预测历史上种群是否发生扩张。中性检验结果表明，宜春地区明月山群体Tajima'sD与Fu'sFs值均为负值，除明月山群体的Tajima'sD值达到极显著水平(即P<0.01)，其他4个群体P值未达到显著水平(P>0.05)，提示这5个群体未经历过扩张时期(表6)。对5个棘胸蛙养殖群体NADH1序列的错配分析发现，碱基歧点分布的期望值成典型的多峰分布，进一步支持江西省5个棘胸蛙养殖群体历史上未经历过种群扩张(图3)。

3 讨论

遗传多样性是衡量种群适应环境变化的关键指标，也是种质遗传资源开发利用的物质基础[11]。本研究采用NADH1序列对江西省5个养殖群体进行了遗传学差异分析，结果表明江西省的棘胸蛙养殖群体具有较高的遗传多样性，XJ与YD群体间遗传分化很小、JX与MY群体间存在低度的遗传分化、其他群体之间存在高度遗传分化。而运用COI基因对这5个养殖群体的遗传多样性分析中，FST指数也表明JX与MY群体遗传分化较低，而XJ与YD及JX群体间存在显著的较高水平的分化差异，表明NADH1比COI适于分析棘胸蛙的遗传结构，选择多个分子标记进行对比分析可以弥补单一标记研究种群遗传多样性的局限性。

江西省5个养殖群体间平均遗传距离较小(0.024～0.035)，AMOVA分析结果显示其遗传变异主要来自于种群内部(63.06%)，群体间变异较小。根据NADH1 序列变异得到的NJ聚类树形成明显的三个单系，江西省各个县区棘胸蛙养殖群体的单倍型呈现出一种混杂的分布格局，错综交织。

采用 Tajima'sD和 Fu'sFs对NADH1 序列进行种群中性检验，明月山群体的Tajima'sD为显著负值，表明该基因偏离了进化的中立性，其他群体均为不显著正值。Fu'sFs检验结果显示明月山群体为不显著负值，其他群体均为不显著正值，显示江西省棘胸蛙养殖群体没有近期扩张的迹象。同时，对江西5个群体NADH1 序列的错配分析发现，碱基歧点分布的期望值成典型的多峰分布，说明江西省棘胸蛙养殖群体历史上未经历过种群扩张。