敲低TPX2对猪卵母细胞纺锤体组装及凋亡的影响

贺依静,李桥,彭磊,李佳,初亚婕,林其昕,芮荣,剧世强

(南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095)

真核细胞有丝分裂过程中纺锤体牵引染色体准确地分布到每个子细胞中,纺锤体的正确组装与定位对细胞命运决定、形态发生与维持起着重要作用[1]。Xklp2靶蛋白(targeting protein for Xklp2,TPX2)是一个纺锤体相关蛋白(microtubule-associated protein,MAP),可以通过多种途径参与纺锤体的定向与组装[2-3]。TPX2作为Ran-GTP(guanosine triphosphate-bound form of Ras-related nuclear protein)通路的一个重要靶点,Ran介导的TPX2在染色体附近被激活后,通过核定位序列(nuclear localization signal,NLS)被Ran-GTP的下游蛋白importin α识别并转运至细胞质后参与微管成核的调控[3-4]。对HeLa细胞的研究表明,TPX2经Ran-GTP/importin α通路释放到纺锤体,通过与AURKA激酶互作调控纺锤体极的稳定性以及微管成核[5-8]。缺乏TPX2时,动粒和染色体臂无法捕获足够的中心体微管组装为纺锤体,导致微管密度降低,纺锤体极不稳定,出现多极纺锤体[9]。

TPX2在细胞周期调控方面也发挥着重要作用,在KEGG通路分析中被列为细胞周期相关蛋白,从S期开始表达至有丝分裂结束[10-11]。对HeLa细胞和HEK293细胞的研究表明,敲低内源性TPX2表达会使细胞阻滞在G2/M期[2,12]。近年来发现TPX2可通过多种通路参与癌细胞的转移、凋亡和增殖等过程的调控[13-14]。对人骨肉瘤细胞的体外研究表明,内源性TPX2可以通过与AURKA互作调节细胞周期[5];TPX2可以抑制前列腺癌细胞中CDK1表达,进一步抑制ERK/GSK3β/SNAIL信号通路,从而促进前列腺癌的上皮-间质转化[11];与非恶性肿瘤相比,TPX2在肝癌组织和细胞系中显著上调,抑制TPX2表达可以下调Wnt通路抑制肝癌细胞增殖,引起肝癌细胞发生凋亡[15];对乳腺癌细胞中的研究表明,沉默TPX2基因会抑制PI3k/AKT/P2Q1信号通路并激活p53信号加速细胞凋亡,抑制细胞增殖[14]。但目前关于TPX2在哺乳动物卵母细胞减数分裂周期中的功能仍知之甚少。

哺乳动物卵母细胞缺乏中心体结构,其纺锤体组装方式与体细胞差异很大[16];卵母细胞减数分裂过程中没有S期,DNA复制一次后细胞连续分裂2次,周期进程与体细胞有丝分裂也有较大差异[17]。那么,在卵母细胞成熟分裂过程中,TPX2是否也参与减数分裂过程中细胞骨架动态分布及细胞周期进程的调控目前尚不明确。本试验以体外成熟培养的猪卵母细胞为研究模型,采用间接免疫荧光染色、蛋白免疫印迹、siRNA显微注射和荧光定量PCR等方法研究TPX2在猪卵母细胞减数分裂进程中对纺锤体组装以及细胞周期的调控作用,以期为更深入了解哺乳动物卵母细胞减数分裂调控机制提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

兔抗TPX2抗体为美国Novus公司产品,兔抗α-Tubulin抗体、Hoechst 33342染料为英国Abcam公司产品,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒为诺唯赞生物科技公司(南京)产品,Prime ScriptTMRT Master Mix为TaKaRa公司产品,SteadyPure通用型RNA提取试剂盒和SYBR®Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒为艾科瑞生物公司(湖南)产品。其他试剂无特殊标注者均为美国Sigma公司产品。

1.2 猪卵母细胞培养与处理

猪卵巢均收集自南京本地屠宰场,收集后立即放入装有37 ℃无菌生理盐水的保温瓶中,2 h内运至实验室,无菌处理后分离卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocytes complexe,COC)。挑选胞质均匀、胞膜完整、包裹3层或3层以上卵丘细胞的COC,置于TCM-199培养液中进行体外成熟培养[18-19]。体外培养44 h后,用0.1%透明质酸酶消化去除卵丘细胞,收集卵母细胞进行后续试验。

1.3 显微注射siRNA干扰TPX2表达

委托上海吉玛基因公司(GenePharma)根据TPX2基因序列(XM_021078098.1)设计TPX2特异性干扰序列对:5′-GCCCUUCGUUCCUAAGAUATT-3′/5′-UAUCUUAGGAACGAAGGGCTT-3′,使用无RNA酶水将siRNA稀释至20 μmol·L-1后于-20 ℃冻存。将COC随机分为对照组(Control group)、阴性对照(Negative control siRNA,NC-siRNA)组和TPX2-siRNA组,分别为无处理组以及注射无意义的siRNA和TPX2-siRNA。将生发泡期(germinal vesicle,GV)的COC置于含2%胎牛血清的TCM199培养液中进行显微注射。平均每枚卵母细胞注射 20 pL siRNA,于体外成熟培养44 h,收集细胞进行后续试验。

1.4 间接免疫荧光染色

将消化后的卵母细胞加入4%(体积分数)的多聚甲醛溶液中室温固定1 h后移入含1% Triton X-100溶液中室温通透过夜;经磷酸盐(PBS)缓冲液清洗3次(每次3 min)后,将卵母细胞转移至含10 g·L-1牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBS中,37 ℃封闭1 h后用兔抗TPX2抗体(1∶1 000)4 ℃孵育8 h,PBS洗涤后用TRITC标记的二抗(1∶100)37 ℃孵育1 h。使用鼠抗α-tubulin-FITC单克隆抗体(1∶200)37 ℃避光孵育2 h;使用Hoechest 33342进行核染色后,置于激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM700 META,Oberkochen,德国)下观察。

1.5 蛋白免疫印迹检测

每组收集80枚卵母细胞,放入聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)蛋白上样缓冲液中煮沸10 min,之后通过PAGE分离样品总蛋白。电泳结束后通过恒流半干转印将蛋白转印至PVDF膜。封闭液为含50 g·L-1脱脂奶粉的TBS,兔抗TPX2抗体和HRP标记的羊抗兔二抗分别按1∶1 000和1∶4 000使用封闭液稀释。将PVDF膜置于封闭液中37 ℃孵育1 h,加入一抗稀释液后于4 ℃孵育过夜,再加入二抗稀释液并于 37 ℃孵育1 h,最后加入ECL化学发光底物孵育30 s,用化学发光成像仪拍照。

1.6 Annexin V-FITC细胞凋亡检测

按照Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书步骤,将洗涤好的卵母细胞置于含10% Annexin V-FITC的染色工作液中,室温避光孵育30 min后转移至4%(体积分数)多聚甲醛溶液中室温固定30 min后封片,置于激光共聚焦荧光显微镜下观察并统计卵母细胞凋亡率。

1.7 凋亡相关基因表达的荧光定量PCR(qPCR)测定

每组80枚卵母细胞,用SteadyPure通用型RNA提取试剂盒提取RNA,再反转录为cDNA,按照SYBR®Green ProTaqHS预混型qPCR试剂盒检测凋亡相关基因mRNA的表达。使用2-ΔΔCT法计算各目的基因mRNA的相对表达水平。引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR引物对序列Table 1 The primer pairs sequences used for real-time quantitative PCR

1.8 数据的处理与统计分析

2 结果与分析

2.1 TPX2在猪卵母细胞减数分裂过程中的亚细胞定位和动态表达

使用对照组卵母细胞,分别在体外成熟培养0、20、28和44 h,收集生发泡期(GV)、生发泡破裂期(germinal vesicle breakdown,GVBD)、第一次减数分裂中期(metaphaseⅠ,MⅠ)和第二次减数分裂中期(metaphase Ⅱ,MⅡ)卵母细胞[20]。间接免疫荧光检测结果如图1所示:在GV期和GVBD期,TPX2没有明显的荧光信号,进入MⅠ期后,TPX2开始在纺锤体两极富集,定位特点与α-tubulin相似。蛋白免疫印迹结果显示,TPX2在猪卵母细胞减数分裂各阶段均有不同程度的表达;在GV期至GVBD期,TPX2蛋白表达量较低,GVBD期后TPX2蛋白表达量逐渐升高,MⅡ期表达量显著高于其他时期(P<0.05)。

图1 TPX2在卵母细胞减数分裂过程的亚细胞定位(A)与表达统计(B)Fig.1 The localization(A)and expression statistics(B)of TPX2 during the meiosis of porcine oocytes 1)GV:生发泡期Germinal vesicle;GVBD:生发泡破裂期Germinal vesicle breakdown;MⅠ:第一次减数分裂中期First metaphase of meiosis;ATⅠ:第一次减数分裂后末期First anaphase-telophase of meiosis;MⅡ:第二次减数分裂中期Second metaphase of meiosis. 红色荧光表示TPX2 Red fluorescence shows TPX2;绿色荧光表示α-tubulin Green fluorescence shows α-tubulin;蓝色荧光表示DNA Blue fluorescence shows nucleus. 2)图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)Values with different superscripts indicate statistical significance at 0.05 level. 下同The same as follows.

2.2 注射siRNA对猪卵母细胞TPX2表达的影响

为探究TPX2在猪卵母细胞细胞减数分裂过程中潜在的作用,向GV期卵母细胞注射TPX2特异性siRNA以干扰内源性TPX2的表达。结果如图2所示:与对照组相比,体外成熟培养44 h后TPX2-siRNA组TPX2蛋白表达量显著下降(P<0.05)。提示注射TPX2特异性siRNA有效敲低了TPX2表达。

图2 显微注射TPX2特异性siRNA 敲低TPX2表达Fig.2 TPX2 knockdown by microinjecting of TPX2-siRNA

2.3 敲低TPX2对猪卵母细胞成熟的影响

卵母细胞第一极体(first polar body,PB1)的排出是卵母细胞成熟的重要标志。在GV期注射TPX2特异性siRNA后体外培养44 h,在体视显微镜下观察PB1的排出情况。结果如图3-A所示:与对照组相比TPX2-siRNA组PB1排出率显著下降(P<0.05),卵母细胞成熟受到抑制。为进一步探究敲低TPX2后卵母细胞成熟失败的原因,试验利用免疫荧光染色对体外培养44 h后的卵母细胞进行细胞周期进程分析,通过纺锤体结构以及染色体特征对细胞所处时期进行划分。统计结果如图3-B所示:TPX2-siRNA组的细胞大多阻滞在GVBD期(36.53%)和第一次减数分裂后末期(anaphaseⅠand telophaseⅠ,ATⅠ)(28.10%),而发育到MⅡ期的卵母细胞比例仅为 23.39%,对照组卵母细胞大部分(67.56%,P<0.05)发育至MⅡ期。

2.4 敲低TPX2对纺锤体结构的影响

为探究敲低TPX2导致卵母细胞减数分裂进程阻滞的原因,检测了敲低TPX2表达后卵母细胞纺锤体的组装情况。结果如图4所示:对照组大多数卵母细胞在体外培养44 h后形成双极纺锤体结构并排出第一极体,而与对照组相比TPX2-siRNA组卵母细胞纺锤体异常率显著升高(P<0.05),主要表现为多极纺锤体或纺锤体崩解等异常情况,并伴随有染色体分离的异常。

2.5 敲低TPX2表达诱导猪卵母细胞发生早期凋亡

本试验通过Annexin V-FITC染色对猪卵母细胞进行早期凋亡鉴定。结果如图5所示:与对照组相比,TPX2-siRNA组中卵母细胞膜上出现明显绿色荧光信号,提示发生了早期凋亡[21]。统计分析显示,TPX2-siRNA组凋亡卵母细胞比例(60.48%)显著高于对照组(19.48%,P<0.05)。进一步检测促凋亡基因Bax、抑凋亡基因Bcl2和凋亡基因Caspase3 mRNA表达量。结果表明,与对照组相比,TPX2-siRNA组Bax/Bcl2值显著上升(P<0.05),Caspase3 mRNA表达显著升高(P<0.05)。这些结果提示敲低TPX2表达会诱导猪卵母细胞发生凋亡。

图3 敲低TPX2对减数分裂进程的影响Fig.3 Effects of TPX2 knockdown on the process of meiosis A.体外培养44 h后细胞形态和第一极体Representative images of first polar body(PB1)extrusion(Arrow:the PB1)after 44 h of culture;B. 第一极体排出率The PB1 extrusion rate;C. 猪卵母细胞减数分裂各时期纺锤体形态和染色体排列的代表性图像Representative images of spindle morphology and chromosome alignment in porcine oocytes during meiotic progression;D. 敲低TPX2表达后细胞周期进程(44 h)TPX2-siRNA interference disrupted the cell cycle progression in porcine oocytes(44 h).

图4 敲低TPX2对纺锤体组装的影响Fig.4 Effects of TPX2-knockdown on the assembly of spindle A. 卵母细胞纺锤体结构和染色体排列的代表性图像Representative images of spindle morphology and chromosomes alignment(蓝色Blue:染色体Chromosome;绿色Green:α-tubulin);B. 纺锤体异常卵母细胞的百分比 Percentage of spindle defects in oocytes.

图5 敲低TPX2表达对卵母细胞凋亡相关基因表达的影响Fig.5 Effects of TPX2-knockdown on apoptosis relative gene expression of oocytes A. 卵母细胞Annexin V-FITC荧光信号的图像 Representative images of Annexin V-FITC staining in oocytes;B. 卵母细胞凋亡率Apoptosis rate of oocytes;C. 相关基因表达水平Relative gene expression level.

3 讨论

TPX2蛋白在纺锤体组装、细胞周期调控等方面的功能一直是细胞有丝分裂调控领域的研究热点,但其在哺乳动物卵母细胞减数分裂中的功能研究尚不多见。本研究以体外成熟过程中的猪卵母细胞为研究对象,结合显微注射、蛋白免疫印迹等方法,探讨了TPX2在猪卵母细胞体外成熟分裂过程中作用的潜在机制。结果发现TPX2蛋白的亚细胞定位与纺锤体动态分布密切相关,干扰TPX2表达后导致纺锤体结构异常,并诱导猪卵母细胞发生凋亡,最终导致其成熟失败。

在猪卵母细胞MⅠ期和MⅡ期,TPX2与微管蛋白α-tubulin呈现共定位趋势,并主要富集在纺锤体两极。这与在HeLa细胞上的研究结果类似,在有丝分裂过程中TPX2最先出现在微管的星状体处,之后逐渐分布在整个纺锤体[22]。这种定位模式提示TPX2参与猪卵母细胞体外成熟过程中的纺锤体组装,与纺锤体稳定性密切相关。蛋白免疫印迹结果显示,在微管蛋白形成早期TPX2的表达量较低,MⅠ期开始逐渐升高且持续表达至MⅡ期。Kim等[23]在猪卵母细胞中的研究表明,无中心体微管组织中心(acentriolar microtubule organization center,aMTOC)的相关成分,如Cep192和PCNT在GVBD期之前均无表达,其模式与本试验中TPX2的表达模式相似,据此文章推测TPX2作为一种纺锤体相关蛋白(MAP),在猪卵母细胞减数分裂过程中可能与aMTOC的形成有关。

显微注射特异性siRNA抑制TPX2表达之后,第一极体排出率显著下降,卵母细胞成熟分裂进程发生阻滞。统计显示,试验组多数细胞阻滞在了GVBD期和ATⅠ期,TPX2-siRNA组大部分卵母细胞出现纺锤体形态异常或纺锤体不稳定,无法正确牵引染色体向纺锤体两极移动。哺乳动物卵母细胞减数分裂要连续经历2次不对称分裂,这个过程中涉及细胞骨架以及细胞周期的精密协调[24]。体外培养44 h后,TPX2-siRNA组出现了微管蛋白α-tubulin密度降低,染色体排列不规则,纺锤体崩解等异常现象,与有丝分裂中的研究结果一致[25],提示TPX2在猪卵母细胞减数分裂过程中与纺锤体组装及染色体的分离密切相关。

体细胞分裂调控相关研究表明,抑制TPX2表达可下调Caspase 3通路,诱导多种癌细胞发生凋亡[14-15,26]。本研究发现,siRNA干扰TPX2表达后猪卵母细胞发生凋亡的比例显著高于对照组,Bax/Bcl2值和Caspase3基因表达量显著上升。这些结果验证了TPX2在猪卵母细胞成熟过程中也会参与细胞凋亡的调控,敲低TPX2的表达会诱导细胞凋亡,与部分癌细胞中的研究结果一致[15,26]。敲低TPX2引起的细胞凋亡可能是卵母细胞的细胞周期阻滞,体外成熟失败的一个重要原因。

综上,本研究结果表明TPX2在卵母细胞减数分裂进程中的表达具有明显的阶段性特点,其亚细胞定位与微管蛋白α-tubulin的动态分布紧密相关。特异性siRNA干扰试验揭示TPX2对猪卵母细胞减数分裂过程中纺锤体的组装及细胞周期的调控具有重要的调节作用。敲低TPX2表达会诱导卵母细胞发生凋亡,最终导致卵母细胞成熟失败。本研究结果为进一步了解卵母细胞减数分裂过程中纺锤体组装、染色体分离等关键环节的调控机制提供了试验依据,也为提高卵母细胞体外成熟质量提供了理论参考。