植物长链非编码RNA调控发育与胁迫应答的研究进展

李建建 贺宸靖 黄小平 向太和

（1.杭州师范大学哈尔科夫学院，杭州 311121；2.杭州师范大学生命与环境科学学院，杭州 311121）

全基因组和转录组分析表明，超过75%的人类基因组和50%的拟南芥基因组转录成RNA；其中，mRNAs 仅占约1.5%，更多的是缺乏蛋白质翻译潜力的非编码RNAs（non-coding RNAs，ncRNAs）。非编码RNAs 包括管家ncRNAs（rRNAs，tRNAs，snRNAs 和snoRNAs）和调控ncRNAs；早期研究更多关注在真核生物转录和转录后调控方面发挥功能的microRNAs 和小干扰RNAs［1-2］。但是，近期研究鉴定了越来越多的长链非编码RNAs（long noncoding RNAs，lncRNAs），其在调控真核生物的生长发育过程发挥重要作用［3］。

由于lncRNAs 表达水平和保守性低，一度被认为是转录副产物。伴随高通量测序技术的快速发展，传统中心法则和基因调控理论受到前所未有的挑战，许多具有关键调控功能的lncRNAs 被鉴定。相对动物lncRNAs，植物lncRNAs 的研究仍处于探索阶段。本文主要针对植物lncRNAs 的来源及分类、作用机制、植物中已鉴定的lncRNAs 及其生物学功能进行综述，为lncRNAs 在作物生产育种中的应用研究提供参考。

1 lncRNAs 的来源及分类

与蛋白编码基因mRNAs 一样，大多数lncRNAs具有5'-帽子、3'-poly（A）尾巴和选择性剪接位点等结构。另外，lncRNAs 主要被RNA 聚合酶Pol II转录，少数也可由RNA Pol IV 和Ⅴ转录产生。但是，目前对于lncRNAs 的起源尚无明确定论，其可能的来源主要有以下5 种：（1）蛋白编码基因在转录过程中结构发生中断形成lncRNA；（2）非编码基因在复制过程发生反移位形成lncRNA；（3）在染色质重组过程中，未转录基因与其他独立基因形成串联，产生lncRNA；（4）在基因组序列中插入转座子形成lncRNA；（5）局部复制子结构发生串联产生lncRNA。

根据lncRNA 与蛋白编码基因的相对位置，可以将lncRNA 分为5 类，包括正义lncRNA（sense lncRNA）、反义lncRNA（antisense lncRNA）、基因间lncRNA（intergenic lncRNA）、内含子lncRNA（intronic lncRNA）和双向lncRNA（bidirectional lnc-RNA）［2］。

2 lncRNAs 的作用机制

大多数lncRNA 没有蛋白质编码能力，但有些lncRNA 具有小的开放阅读框，能够编码短肽。另外，lncRNA 可以通过调控基因转录、组蛋白修饰、RNA加工、以及与小RNA 作用发挥功能。有文献报道lncRNA 主要以信号分子、诱饵分子、引导分子和支架分子4 种形式参与生物学过程（图1）［4］。

图1 lncRNA 四种作用机制示意图Fig.1 Schematic diagram of the four archetypes of lncRNA mechanism

在春化作用研究中，开花基因FLC的表达受lncRNA（COOLAIR和COLDAIR） 的调控，而COLDAIR的表达变化影响拟南芥应答春化［5］；另外，有研究报道了一个光敏育性相关lncRNALDMAR，其序列产生C-G 的单碱基突变导致其表达水平降低，花药PCD 提前，造成光敏雄性不育［6］，表明lncRNA 是植物生长发育的一个信号标志。

LncRNA 作为诱饵分子竞争性结合RNA 结合蛋白调控目的基因的表达［4］。此外，lncRNA 作为miRNA 的伪靶标基因与miRNA 相互作用调控靶基因的表达［7］。拟南芥lncRNAIPS1竞争性结合miRNA399 造成其靶基因PHO2大量积累，降低特异性磷转运基因Pht1；8和Pht1；9的表达，导致根部对磷吸收减少［8］。

LncRNA 作为引导分子指导核糖核蛋白复合体定位在特定位点。LncRNA 通过cis-/trans-调控基因表达。研究表明苜蓿根瘤基因Enod40编码的lncRNA 能直接与MtRBP1 蛋白结合，参与MtRBP1从细胞核至细胞质中的定位过程［9］。

除了上述3 种作用形式之外，lncRNA 还可以作为骨架分子结合不同蛋白质或者转录因子形成蛋白复合体，调控基因上下游效应元件从而激活或者抑制基因转录。比如，植物lncRNA 与AGO4 蛋白互相作用，指导siRNA-AGO4 复合体转移至相关染色质目的位点进行RNA 介导的DNA 甲基化。这类lncRNA 功能复杂，尚不清楚这些骨架复合体如何实现组织和调控。

3 植物lncRNAs 的功能

3.1 lncRNAs调控植物营养器官发育

根、茎、叶等营养器官参与维持植物生命活动。有研究报道，杨树Lnc12和LncWOX11调控相关mRNAs 的表达从而抑制杨树不定根的形成与发育［10］。在拟南芥中，lncRNAENOD40或lnc351与核斑RNA 结合蛋白AtNSRs 结合，调控NSR 对下游生长素应答基因的可变剪接，参与侧根发育［11］。另外，在大豆［12］、水稻［13］、苜蓿［14-15］中均鉴定了一种与根瘤特异性表达和共生固氮根瘤形成有关的lncRNAENOD40。

与同期野生型棉花相比，过表达靶基因whole_GLEAN_10025325植株的纤维细胞含量减少，韧皮纤维明显增多；将lncRNALTCONS_00034183及其靶基因共转化发现，转基因植株纤维细胞含量减少，纤维含量减少［16］。有研究分析不同发育时期棉花纤维转录组数据鉴定了5 个优势表达lncRNAs，其中lncRNAGhir_A01G011040-RNAi 转基因株系的纤维显著变短［17］。另外，Zhao 等［18］发现异源四倍体棉花A 亚基因组中lncRNAXLOC_409583在多倍体化后被激活并参与调控棉花株高。

在红苞凤梨中，lncRNAlncABCG11顺式调控PORB的表达调控叶色［19］。Wang 等［20］鉴定了一个持续红光条件下促进拟南芥光形态发生的lncRNAHID1，其能和抑制光形态的光敏色素互作因子PIF3相互作用；在hid1突变体中HID1敲低表达导致PIF3显著上调表达，促进下胚轴的伸长发育。另外，Liu 等［21］鉴定了一种由R2R3 MYB转录因子OsMYB60反义链转录产生的反义lncRNATWISTED LEAF（TL），TL-RNAi 株系和过表达OsMYB60转基因株系叶片扭曲，在TL-RNAi 转基因株系中OsMYB60显著上调表达，表明反义lncRNATL顺式调控OsMYB60参与叶形态发育。植物营养器官的正常发育被认为是转向生殖发育的基础，上述研究揭示了lncRNAs 调控植物营养器官的重要作用。

3.2 lncRNAs调控植物生殖器官发育

3.2.1 lncRNAs 调控植物开花 成花转变是植物生殖发育的一个重要环节，受到包括春化作用在内的多种途径调控。在春化过程中，开花抑制因子FLC 的表达受表观遗传学负向调控，促进FLC上H3K4me3 去组蛋白修饰和H3K27me3 组蛋白修饰，抑制FLC 的表达，解除其对下游开花基因的抑制作用实现开花转变［22］。研究证实，3 个拟南芥lncRNAs（COOLAIR、COLDAIR、COLDWRAP）均能调控FLC的表达参与开花［5，23-24］。

Zhao 等［3］鉴定了一个自然反义长链非编码RNAMAS，其转录于FLC家族成员基因MAF4的反义链；相较于野生型，转基因株系maf4-1及amiRMAS-1/2均提前开花。在拟南芥中，编码核外泌体组分的两个基因AtRRP6L1和AtRRP6L2突变导致关键开花抑制因子FLC去阻遏，促使早开花生态型拟南芥延迟开花；此外，AtRRP6L 蛋白质影响lncRNAASL的表达进而负调控FLC，影响植物开花进程［25］。全基因组分析鉴定了14 个拟南芥反义lncRNAs，其中lncRNA npc48 过表达转基因株系开花推迟［26］。Henriques 等［27］鉴定了CDF5的天然反义转录本lncRNAFLORE；其中，CDF5 蛋白直接抑制FT基因的转录从而延迟开花，FLORE通过抑制CDF1、CDF3和CDF5等几个基因和增加FT的转录促进开花。

在六倍体小麦中，一个转录自TaVRN1正义链的lncRNAVAS过表达转基因冬小麦提前开花［28］。开花是高等植物由营养生长向生殖生长转换的一个关键过程，上述研究暗示lncRNA 在植物开花方面的重要性。

3.2.2 lncRNAs 调控有性生殖及花粉发育 花粉发育是植物生殖发育过程中至关重要的部分。Fan 等［29］鉴定了一个光敏不育性位点Pms1编码一个优先在水稻幼穗中表达的lncRNAPMS1T，其与miR2118结合产生一个长日照条件下优先在光敏雄性不育水稻积累的21 nt phasiRNAs，进而参与水稻生殖发育。另外，LDMAR次级结构的改变会增强LDMAR启动子区域甲基化修饰水平，导致LDMAR的转录显著受阻，最终造成花药过早程序性细胞死亡，形成光敏雄性不育［6］。Zhang 等［30］对水稻花药、雌蕊和授粉后5 d 的种子进行高通量测序，鉴定了多个水稻生殖相关的lncRNAs；其中lncRNAXLOC_057324突变体开花提前，育性显著降低。

Song 等［31-32］发现lncRNABcMF11表达水平降低造成异常的花粉发育，包括绒毡层降解、小孢子非同步分离及花粉粒的异常发育，最终导致败育表型。在菜心研究中，过表达lncRNABrLMaP导致花粉发育异常［33］。Huang 等［34］对5 个发育阶段的油菜进行RNA-Seq 分析，鉴定了12 051 个lncRNAs；其中lncRNAsbra-eTM160-1和bra-eTM160-2是bramiR160-5p的潜在eTM，其过表达转基因株系花器官外表正常，但花药内一半花粉粒小且皱缩，没有育性、无细胞核及花粉内壁缺失。

在玉米花药中，敲低lncRNAZm401显著影响与花粉发育相关基因（ZmMADS2、MZm3-3和ZmC5）的表达，导致小孢子和绒毛层的发育异常，最终造成玉米雄性不育［35］。上述研究结果表明，现已研究的lncRNAs 与植物有性生殖密切相关，相信进一步的研究将发现更多调控植物生殖的lncRNA。

3.2.3 lncRNAs 调控植物成熟与衰老 除了参与花粉发育，lncRNA 也调控植物果实成熟与衰老。Li 等［36］采用CRISPR-Cas9 技术敲除lncRNA1459导致西红柿果实成熟进程受到抑制，乙烯和番茄红素的产生受抑制，大量乙烯和类胡萝卜素相关基因表达水平降低，果实成熟相关基因表达水平显著性改变。此外，研究报道西红柿lncRNA1840沉默株系的果实明显延迟成熟［37］。

众所周知，水稻高产和早熟是一对影响水稻产量提高的重要矛盾。Fang 等［38］鉴定了一个OsSOC1基因的长非编码RNA 反义转录本Ef-cd；实验结果表明Ef-cd能够促进氮利用及提高光合作用速率，进而参与调控水稻成熟。另外，Wang 等［39］从一个水稻产量性状相关基因簇LRK 上游鉴定了一个反义lncRNALAIR；水稻LAIR过表达引起LRK基因簇部分基因的转录上调，改变LRK1基因组位点的组蛋白修饰状态，导致水稻增产。

田芸芸［40］对河套密瓜4 个发育时期的中果皮进行转录组测序，鉴定了1 601 个差异表达lncRNAs；其中LNC-003610超表达株系的成熟天数较对照组推迟约7 d，表明LNC-003610是果实成熟的负调控因子。

有研究报道，lncRNA 作为一类新型非编码RNA，其竞争性结合miRNA 和circRNA，进而调控mRNA 的表达水平。本课题组前期全基因组研究鉴定了水稻叶衰老非编码lncRNAs 及其共表达靶基因mRNAs；探明衰老相关lncRNAs 既可通过调控其靶基因发挥功能也可通过竞争内源性RNA 网络调控mRNAs 发挥功能；采用过表达和CRISPR-Cas9 技术的转基因功能验证实验已完成，功能机制被进一步阐明［41］。

3.2.4 lncRNAs 调控种子及胚乳发育 种子休眠是植物生命循环中最关键的过渡时期之一，该时期受DOG1基因控制。Fedak 等［42］鉴定了一个反义lncRNADOG1，命名为asDOG1；在种子成熟阶段，asDOG1顺式负调控种子休眠导致DOG1等位基因特异性抑制并促进萌发。

此外，中山大学陈月琴团队鉴定了一个母本来源、调控胚乳发育的lncRNAMISSEN；功能研究显示，超表达MISSEN 导致合胞体阶段游离胚乳细胞核数目减少、聚集以及后续细胞化受阻；而MISSENRNAi 导致胚乳细胞化的进程更快，导致种子出现明显的“大肚子”表型［43］，表明lncRNA 在胚乳发育过程发挥重要作用。

3.3 lncRNAs应答植物非生物胁迫

3.3.1 lncRNAs 应答植物盐胁迫 植物在整个生命周期会遭受众多不利的环境，包括盐胁迫、干旱胁迫、低温胁迫、营养胁迫等过程。在磷缺乏条件下，采用RNAi 技术敲低cis-NATPHO1；2表达导致PHO1；2 蛋白减少，损害磷酸盐从根部向地上部的运输，导致种子产量减少；相反，在磷供应充足条件下，trans-NATPHO1；2组成型过表达导致PHO1；2表达水平显著增加；上述结果表明cis-NATPHO1；2在促进PHO1；2 蛋白翻译、维持磷酸盐稳态及植物健康方面发挥重要作用［44］。lncRNAMt4是苜蓿中最早被鉴定的磷酸盐饥饿诱导基因，该基因在Pi 饥饿期间在根中下调表达［45-46］。在低磷胁迫下，拟南芥中的lncRNAIPS1充当miR399的靶标，竞争性结合miR399，增加miR399 靶基因PHO2的表达，维持植株在低磷状态下的生长［8］。与IPS1一样，AT4过度表达导致Pi 积累减少，同时IPS1和AT4过度表达均显著抑制了miR-399对PHO2的切割，表明IPS1和AT4通过抑制miR-399的活性维持磷酸盐稳态［8］。与野生型相比，过表达npc536拟南芥转基因株系在盐胁迫条件下促进根系生长［26］。

Zhang 等［47］发现过表达lncRNA973的拟南芥种子萌发率提高、鲜重增加、根长增加；采用病毒诱导的基因沉默技术敲低lncRNA973的转基因株系叶片枯萎、黄化。此外，Liu 等［48］鉴定了一个拟南芥lncRNAT5120，过量表达T5120转基因拟南芥促进硝酸盐应答、增强硝酸盐同化、提高生物量和根系发育；T5120可部分恢复硝酸盐调节转录因子NLP7突变株的硝酸盐信号和同化表型；上述结果表明T5120参与调控硝酸盐胁迫响应。

在盐胁迫条件下，过表达lncRNAThSAIR6显著减轻柽柳细胞的受损程度，增强POD 和SOD 酶活性，降低植株体内H2O2和O2-的含量，提高活性氧的清除能力，有效提高刚毛柽柳的耐盐性［49］。除此之外，过表达lncRNAThSAIR1-5转基因株系同样提高刚毛柽柳的耐盐性［50］。总之，一定程度的盐胁迫会引起渗透胁迫和次生氧化胁迫，导致植物养分失衡及抑制植物生长，表明lncRNAs 在盐胁迫方面的作用至关重要。

3.3.2 lncRNAs 应答植物温度胁迫 温度是影响植物生长发育的最重要的环境因子之一，温度的细微变化能极大地影响植物的生长和发育。

研究发现，超表达lncRNAHAL6拟南芥的萌发率和存活率显著高于野生型，显著增强高温胁迫抗性；反之，RNAi 株系对高温胁迫敏感，表明lncRNAHAL6参与调控植物高温胁迫［51］。在拟南芥中，热激转录因子HSFB2a过表达降低反义lncRNAasHSFB2表达水平，导致生殖发育阶段的拟南芥生物量提高；反之，asHSFB2过表达抑制HSFB2a表达，导致生物量降低［52］。除此之外，在拟南芥基因组冷敏感区域鉴定了一个lncRNASVALKA，过表达SVALKA抑制CBF1表达调控植物的耐寒性［53］，这些研究揭示了lncRNAs 在温度胁迫响应过程的重要作用。

3.3.3 lncRNAs 应答植物干旱胁迫 水分缺失是植物生长的主要限制因素之一。植物遭受干旱胁迫时，消耗量大于吸收量，植物细胞内水势和膨压降低，导致叶片凋萎，甚至植株死亡。

与野生型拟南芥相比，lincRNA13853功能缺失突变体对外源ABA 的敏感性减弱、耐旱性降低、失水率加快及气孔孔径比增大；过表达lincRNA13853植株的气孔孔径比减小；上述结果表明lincRNA可能通过调节气孔形态影响蒸腾速率，最终改变植物的耐旱性［54］。拟南芥过表达转基因株系At5NC056820-3、At5NC056820-7和At5NC056820-8在干旱胁迫下长势更好，游离脯氨酸含量是野生型的2-2.5 倍；表明lncRNAAt5NC056820在一定程度上可以提高拟南芥的耐旱性［55］。拟南芥lncRNADRIR在非胁迫条件下表达水平很低，在干旱胁迫下被显著激活；过表达lncRNADRIR转基因株系提高干旱胁迫抗性［56］。这些研究表明，lncRNAs 在植物对干旱胁迫的响应中起着不可忽视的作用。

3.3.4 lncRNAs 应答植物其他非生物胁迫 除了盐胁迫、高/低温胁迫和干旱胁迫外，植物lncRNAs还参与了其他影响生长发育的胁迫应答。Sun 等［57］鉴定了一个受Fe 缺乏诱导表达的苹果lncRNAMSTRG.85814；其正向促进SAUR32的表达并激活质子分泌以应答Fe 缺乏。

Wu 等［58］发现AtR8响应低氧胁迫和水杨酸胁迫；在低氧胁迫下，AtR8表达量降低，而在水杨酸胁迫下表达量升高。进一步的研究表明，在拟南芥atr8突变体中，低浓度SA 导致根长显著变短［59］。

植物激素赤霉素在植物体内发挥重要的生长调节作用。王亚丽［60］鉴定了一个赤霉素响应lncRNAGARR2，采用CRISPR-Cas9 技术获得的转基因株系较野生型株高和第二叶鞘长极显著增加，籽粒长和籽粒宽极显著降低。

在真核生物基因组中，转座子元件（transposable elements，TEs）广泛存在。有研究报道拟南芥TElincRNA 11195突变体对ABA 敏感性降低，具有更长的根系及更高的地上部生物量［61］。

另外，拟南芥APOLO-RNAi 转基因株系表现为延迟的向地性响应，在不影响侧根密度条件下有更长的根系［62］。

3.4 lncRNAs应答植物生物胁迫

植物除了受到非生物胁迫，而且还会受到生物胁迫的作用，包括细菌、真菌、病毒和害虫的侵害。

有研究报道，过表达lncRNA16397 和SIGRX的转基因番茄在感染马铃薯晚疫病（Phytophthora infestans，P.infestans）后的症状和活性氧积累均较野生型更轻、更低，表现为对P.infestans增强的抗性［63］。过表达lncRNA23468的转基因番茄中miR482b 表达水平显著降低，miR482b 靶基因NBSLRRs显著上调表达，导致对P.infestans抗性增强；反之，沉默lncRNA23468转基因番茄的抗性减弱［64］。经启动子-β-GUS 融合和酵母单杂交试验证明lncRNA33732能与WRKY1 启动子元件相互作用，激活lncRNA33732的表达；lncRNA33732过表达和沉默的转基因株系诱导RBOH基因的表达，增加H2O2的积累，导致对P.infestans抗性增强；当RBOH基因表达受到抑制时，H2O2积累降低，对病原菌的抗性减弱［65］。过表达lncRNA39026转基因番茄表现的增强P.infestans抗性；相反，沉默lncRNA39026的转基因株系抗性减弱［66］。

番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）是一种通过烟粉虱快速传播的毁灭性番茄病害。Wang 等［67］鉴定了一个番茄lncRNAS-slylnc0957，其沉默导致敏感番茄植株对TYLCV 的抗性增强。此外，番茄lncRNASILNR1不仅影响番茄叶片发育，而且在番茄TYLCV感染期间，与TYLCV 的非编码基因间区衍生的病毒小干扰RNA 相互作用，从而调控疾病防御［68］。

另外，Yu 等［69］用增强子系统构建的T-DNA 插入株系表现增强的白叶枯抗性。Zhu 等［70］用尖孢镰刀菌侵染拟南芥，发现lncRNATAR-197转基因株系发病更早且症状更严重，TAR-212转基因株系表现增强的疾病防御抗性。植物免疫应答是一个涉及基因表达转录和转录后调控的复杂过程。Seo 等［71］采用人工miRNA 技术敲低lncRNAELENA1，发现其转基因株系表现为PR1 下调表达及对番茄DC3000细菌病原体丁香假单胞菌更敏感；相反，过表达ELENA1的转基因株系表现为PR1 表达水平上调及增强的病原菌抗性。

Gao 等［72］发现皱缩病毒侵染lincRNALINCAP2过表达植株后其靶基因AP2 下调表达，发病症状更严重，包括花结构变形。Zhang 等［73］鉴定了两个棉花lncRNAsGhlncNAT-ANX2和GhlncNAT-RLP7，沉默转基因幼苗表现为增强的黄萎病和灰霉病抗性。总之，作为植物防御机制的一部分，lncRNAs 在植物病原体等生物响应方面发挥重要作用。

本文综述了植物lncRNAs 发挥的主要生物学功能并总结了转基因功能验证的lncRNAs（表1）。

表1 参与植物发育和胁迫应答的已功能验证的lncRNAsTable 1 Functional validated lncRNAs involving in plant development and stress response

4 展望

随着高通量测序技术和生物信息学的快速发展，越来越多的植物和动物lncRNA 被广泛鉴定。相较于早期研究，lncRNA 并不被认为是转录副产物，而是能在表观遗传、转录调控及转录后调控等层面参与基因表达调控的重要基因组分。众所周知，lncRNA 参与了大量生物学过程，包括生长发育、胁迫、免疫反应、疾病防御等。然而，与mRNA 相关的数据库相比，lncRNA 植物相关数据库及其注释还不够完全，对其进行深入分析的难度较大；除此之外，lncRNA 的研究还存在一些问题：比如，lncRNA 作用机制复杂；许多lncRNA 的生物学功能无法阐明；非编码转录产物是否有功能依然无法判断等。

为了更好阐明lncRNA 的生物学功能和作用机制，可以从以下思路入手：采用纳米孔测序技术获得lncRNA 全长、通过单细胞转录组和表观遗传组建立lncRNA 与染色质之间的联系、对lncRNA 靶基因进行预测并进行功能验证；目前，采用过表达和CRISPR/Cas9 技术对lncRNA 及其靶基因的功能验证仍显不足，尤其是在植物中的研究。

除此之外，对lncRNA 的报道主要集中在分子机制的研究中，在育种方面鲜见报道。探索lncRNAs 对植物生长发育影响的分子机制的成熟，lncRNA 有望在农业育种、种质创新及品质改良方面发挥重要作用。