基于转录组测序的创伤早期小鼠腹腔巨噬细胞差异表达基因的分析及验证

殷双琴，罗 莉 ，陈 涛,2，梁星河,2，旷田垠，代伟宏,3，梁华平，朱俊宇

1.陆军军医大学大坪医院战伤感染与特需药品研究室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400042； 2.陆军军医大学基础医学院学员旅17队，重庆 400038； 3.海南医学院第二附属医院，海口 571199

创伤是一个世界性的公共卫生问题，呈逐年增长趋势。创伤后第三死亡高峰期的主因是创伤后感染引起的脓毒症、多器官功能障碍综合征等并发症。虽然临床上对创伤的防治措施不断改进，但是伤后感染的发生率及病死率仍然居高不下，已成为阻碍危重症患者救治成功率的主要瓶颈[1-2]。究其原因，还是对创伤后机体抗感染免疫防御功能的变化及机制认识不够深入。

研究证明，创伤后免疫功能紊乱尤其是巨噬细胞(macrophage,Mφ)功能障碍是导致机体抗感染能力减弱的主要原因之一[3]，巨噬细胞在固有免疫和适应性免疫反应介导的抗感染应答中发挥主导作用，其双向性功能改变(炎性介质生成增多、吞噬杀菌及抗原提呈能力降低)在引发创伤后免疫功能紊乱中扮演重要角色[4]。严重创伤不仅可致巨噬细胞的吞噬、杀菌功能降低，抗原提呈功能减弱，还可改变其活化状态、抗原表达、分泌功能及相关蛋白酶水平。虽然已证实创伤可导致巨噬细胞上述功能的改变，但其抗感染能力减弱的具体机制仍需进一步阐明，尤其在对病毒、细菌感染以及干扰素(interferon,IFN)刺激的反应性方面还未完全明晰，而且目前学界缺乏对创伤后巨噬细胞转录组和基因表达谱变化的系统性认识。转录组测序(RNA sequencing，RNA-seq)技术[5]可以捕捉不同组织或状态下的转录组动态变化，通过分析不同因素作用下的基因在RNA水平表达的差异，可以将显著差异表达的基因与某些生物学功能联系起来，用于检测早期变化指标和分子调控机制的研究。

本研究利用RNA-seq技术，建立小鼠严重创伤模型并动态提取腹腔巨噬细胞的RNA，对其进行基因功能和信号通路富集分析，深入研究严重创伤后不同时间点巨噬细胞转录组的变化规律，分析差异基因的变化情况，并提出创伤后抗感染能力减弱新的机制和可能的免疫调节干预靶点。

材料与方法

1 实验动物

纳入40只雄性6周龄C57BL/6小鼠(SPF级，购自斯贝福生物技术有限公司，北京)，体重20～22g，动物房室内温度为19～23℃，相对湿度为40%～70% ，采用12h昼夜交替照明方式，小鼠可自由饮水进食。实验动物饲喂养于陆军军医大学大坪医院实验动物中心SPF级动物房内，实验单位使用许可证号:SYXK(渝)20170002。本研究所涉及的动物实验由陆军军医大学伦理委员会批准(AMUWEC20211429)。

2 主要试剂

高纯总RNA快速提取试剂盒购自百泰克公司，PrimeScript RT reagent Kit试剂盒、SYBR®Prime Ex TaqTMII试剂盒均购自日本宝日医生物技术有限公司(TAKARA)，PCR引物由北京擎科生物科技公司合成。红细胞裂解液购自天津灏洋华科生物科技有限公司，氯仿购自成都市科隆化学品有限公司。

3 动物处理与分组

将40只C57BL/6小鼠随机分为4组：对照组、创伤后2h组(TH2h组)、创伤后6h组(TH6h组)、创伤后12h组(TH12h组)，各10只。分别建立小鼠双下肢股骨骨折+眼球40%失血模型，采取钳夹双后肢造成股骨非开放性骨折，同时复合眼眶放血30%～40%(全血量由体重的6%计算)。各组小鼠分别在未创伤和创伤后、2h、6h、12h立即脱颈处死，提取腹腔巨噬细胞进行下步实验。

4 腹腔巨噬细胞总RNA提取

每只小鼠腹腔灌洗5mL冰生理盐水，提取腹腔灌洗液后300g离心5min，每组加入2mL红细胞裂解液后静置3min，裂解红细胞后铺板，腹腔巨噬细胞贴壁2h后，弃去培养上清，加入磷酸盐缓冲液洗涤2次，加入1mL Trizol收集贴壁原代腹腔巨噬细胞总RNA，按照RNA提取试剂盒步骤提取RNA，检测RNA的浓度和纯度。于-80℃保存，并送往上海美吉生物进行RNA-seq。测序数据比对小鼠参考基因组(http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Info/Index)。

5 差异表达基因筛选

基于表达量定量结果，进行组间差异基因分析，获得两组间的差异表达基因，差异分析软件为：DEGseq，筛选阈值为：|log2FC|≥1 &P<0.01。将对照组vs.TH2h组、对照组vs.TH6h组、对照组vs.TH12h组3组间的差异基因取交集得到3组共有的目标差异表达基因。

6 目标差异表达基因的GO、代谢通路(KEGG)富集分析

为了进一步了解差异表达基因的功能，阐述其在分子水平上的作用，通过使用Blast2go功能注释工具和GO数据库(http://www.geneontology.org/)对得到的目标差异表达基因进行GO注释，并采用KOBAS(Version 2.1.1)与 KEGG 数据库(http://www.genome.jp/kegg/)进行KEGG注释。

7 差异表达基因的验证

笔者从差异表达基因中挑选了部分感兴趣基因进行了实时荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)验证。反应体系为10μL，包括5μL的SYBR prime Ex TaqTM II，1μL 的cDNA 模板，0.5μL 的10μM PCR forward primer，0.5μL 的10μM PCR reverse primer和 3.0μL 的Rnase free dH2O。反应条件为：95℃预变性 3min；95℃ 变性10s，60℃ 退火30s，变性和退火重复35个循环；95℃10s，65℃～95℃融解曲线0.5℃增加3min。每个基因做3次重复，β-actin作为内参基因，反应结束后使用Bio-Rad CFX Manager 3.1软件分析结果，采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量，利用GraphPad软件分析显著性并作图，P<0.05为差异有统计学意义。引物序列见表1。

结 果

1 差异表达基因分析

使用TPM方法分析对照组与各个创伤组(TH2h组、TH6h组、TH12h组)间的差异表达基因，将数据进行标准化后分析其表达水平，差异表达基因的筛选条件为|log2FC| >=1 &P<0.01。与对照组相比，TH2h组有903个差异表达基因，其中有296个表达水平上调，607个下调。TH6h组有1 337个差异表达基因，其中有688个表达水平上调，649个下调。TH12h组有1 720个差异表达基因，其中有884个表达水平上调，836个下调。见图1。

图1 差异表达基因数量

2 差异基因集Venn分析

通过Venn图分析对照组vs.TH2h组、对照组vs.TH6h组、对照组vs.TH12h组3组间的差异基因交集，结果表明，313个差异表达基因在3组间差异均有统计学意义，为目标基因集。见图2。

图2 创伤后2、6、12h的差异表达基因集共有的差异表达基因维恩图

3 差异表达基因的GO功能富集分析

GO富集的条目分为细胞组分、生物进程(BP)和分子功能。GO功能富集分析表明(表2)，目标差异表达基因主要富集于BPs，如对细胞因子的响应、固有免疫反应、对干扰素α响应、对干扰素β响应以及对病毒的防御反应等。此外，GO富集的前20位GO条目中，“干扰素β的细胞响应”的富集指数最大，富集程度较为明显。见图3。

表2 富集丰度在前20的GO条目

4 干扰素诱导(interferon-induced，Ifi)相关的差异表达基因聚类分析

GO富集分析表明差异基因富集程度最大是对干扰素β的细胞反应，笔者挑取了这313个差异表达基因中属于Ifi相关差异表达基因(分别为：Ifi35、Ifi202b、Ifi44、Ifit1、Ifi206、Ifi209、Ifit2、Ifit3b、Ifi208、Ifit1bl2、Ifi214、Ifi213、Ifit3、Ifi47、Ifit1bl1)进行下一步聚类分析。结果表明，与对照组相比，TH2h组、TH6h组、TH12h组的Ifi相关基因的转录水平均明显下降(图4)，说明严重创伤导致小鼠腹腔巨噬细胞Ifi相关基因的表达降低，并表现为一定程度的时间依赖性，从伤后2h开始至伤后12h持续下调。

图4 干扰素诱导相关基因在对照组、TH2h组、TH6h组、TH12h组的表达量聚类热图

5 qPCR 验证分析

选择上述聚类中的15个Ifi基因(分别为：Ifi35、Ifi202b、Ifi44、Ifit1、Ifi206、Ifi209、Ifit2、Ifit3b、Ifi208、Ifit1bl2、Ifi214、Ifi213、Ifit3、Ifi47、Ifit1bl1)进行差异表达基因验证。qPCR法检测结果显示上述Ifi家族15个基因表达均下调，qPCR测得各基因表达变化下降趋势与RNA-seq结果一致(P<0.05)。见图5。

图5 干扰素诱导相关基因在创伤后2、6、12h的腹腔巨噬细胞中的相对表达水平表达量为相对表达量，对照组中的表达量为对照。每个值代表3次重复的代表试验组与对照组的差异显著性(**P<0.01)

讨 论

严重创伤诱发机体免疫功能紊乱是造成创伤后感染/脓毒症的主要原因。创伤-失血后机体的特异性和非特异性免疫功能均处于紊乱状态,使机体对病毒、细菌、真菌等病原体感染的易感性增加，加剧了创伤后感染/脓毒症的发生[6]。但是，创伤-失血后巨噬细胞抗感染能力减弱的具体机制还未完全明晰，本研究利用RNA-seq技术有助于系统性探究其变化规律，为进一步阐明机制及寻找干预靶点奠定基础。

本研究构建小鼠双下肢股骨骨折+眼球40%失血的严重创伤模型，取对照及造模后2、6、12h的小鼠腹腔巨噬细胞提取RNA并进行RNA-seq，通过差异表达基因分析，发现创伤-失血后腹腔巨噬细胞出现大量的基因表达变化，除伤后2h下调较上调基因数多外，6h和12h上调和下调基因数接近。在12h内随着时间的增加，差异表达基因的数量持续增加(图1)。创伤早期12h内巨噬细胞的变化不仅是机体应激的反应，而且还预示着后期发生感染的可能。多数严重创伤患者感染的高发期多在1周左右。前期学者报道，在创伤-失血性休克模型下，腹腔巨噬细胞的吞噬功能减弱，主要组织相容性复合体Ⅱ类抗原表达降低，TNF-α的释放减少，这些变化持续较长时间并可达伤后7d[7]。上述事实均表明创伤失血后对巨噬细胞基因转录和免疫功能的影响是持续的，易导致后续感染的发生。为了探究在创伤后不同时间点均持续变化的基因，笔者团队利用Venn分析筛选出313个差异表达基因的目标基因集(图2)，进一步GO功能富集分析发现该基因集主要富集于BPs，如对细胞因子的响应、固有免疫反应、对干扰素α响应、对干扰素β响应以及对病毒的防御反应等(表2、图3)。上述差异基因主要参与了对Ⅰ型干扰素和病毒的反应。众所周知，在病毒感染的早期，机体通过模式识别受体识别病原体相关分子模式PAMPAs，迅速诱发Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)的表达并促使一系列干扰素刺激基因(interferon-stimulated gene,ISG)的表达，增强细胞的抗病毒能力，并诱发病毒感染细胞的凋亡，从而限制病毒的复制和传播，为病毒感染提供第一道防线[8]。免疫调节干预措施IFN-γ有助于增加宿主的抗原提呈能力，但随机对照临床RCT试验表明IFN-γ的作用效果存在争议，在4项研究中仅有2项降低病死率和感染发生率[3]，提示IFN的确切作用还需深入探究及证实。多年来，IFN被证明具有多种生物学功能，在抗病毒感染应答、免疫调节和抗肿瘤方面具有重要作用。文献报道，HIV病毒感染会下调原代巨噬细胞中许多ISG(IFI27，IFI44，IFI44L和ISG15)的转录[9]。与艾滋患者感染HIV病毒后免疫抑制状态类似，创伤-失血后巨噬细胞中ISG的转录也明显降低，可能与严重创伤患者表现的免疫功能紊乱相关。

综合分析基因富集结果发现，GO功能富集气泡图中，“干扰素β的响应”这一GO条目的富集因子最大，富集的基因数较多。在上述条目中，存在大量Ifi相关基因，而且这些基因本身就是抗感染早期的重要指标。笔者挑选了15个Ifi基因进行基因聚类分析(图4)，发现创伤后这些基因的表达水平均降低，而且RT-qPCR验证结果与测序一致(图5) 。其中Ifit家族基因在干扰素应答过程中高表达，在小鼠中有3个Ifit家族成员(Ifit1/ Ifit2/ Ifit3)，在人类中多1个Ifit5共有4个成员，已被证实具有直接或间接的抗病毒活性、诱导细胞凋亡、调控病毒和细菌感染期间宿主先天免疫反应、调节炎症因子反应等作用[10]，也可作为M1型巨噬细胞的最新极化标志物[11]。Ifit1已被认为是巨噬细胞先天免疫重要的瓶颈，对下游基因和先天性免疫功能具有关键调节作用[12]。Ifit1的敲除促进了诺如病毒在细胞内的复制，Ifit1并不直接抑制病毒翻译，而是通过促进巨噬细胞中干扰素β的表达，从而限制病毒复制[13]。Ifit2也可通过促进巨噬细胞IFN-α/β的诱导表达，限制了西尼罗河病毒在大脑的感染[14]。Ifit1不仅是一种抗病毒蛋白，近来也被证明是细菌诱导的促炎基因和干扰素基因的相互调节因子，与染色质调节因子共同调节转录和宿主对细菌感染的反应[15]。Ifit1对于巨噬细胞有效控制革兰氏阴性细菌感染十分关键，Ifit1缺失增强了机体对细菌的敏感性，表明Ifit1对基因表达的调控对于维持宿主细胞中病原体感染的抗性和转录平衡至关重要[15]。这些结果表明Ifi基因表达水平的下降可能是导致创伤后机体的抗病毒、细菌感染和免疫能力降低的重要原因，但其具体机制还需进一步研究。

其他结果指出，Ifit的下调也可能是一种代偿性保护机制。Ifit2促进炎症反应的级联放大，可能参与了感染性休克的发生。IFN刺激的Ifit2通过增强IRF3磷酸化上调促炎细胞因子的分泌，Ifit2缺陷小鼠的血清IL-6和TNF-α水平显著降低[16]。Ifit3基因的敲除和表达下调，不仅可缓解心肌梗死小鼠的炎症反应和心肌纤维化，改善其心功能[11]，还能改善肝脏缺血再灌注损伤，抑制炎性细胞因子的释放[17]。Ifi35有助于增加免疫细胞的招募和IL-12p40的产生，与H5N1流感病毒感染的易感性增加有关[18]。此外，Ifi202b是参与单核巨噬细胞分化和促进炎症消退的关键因子，有助于伤口的愈合[19]，Ifi202b敲低阻断了基质血管部分的脂肪生成并减少了骨髓来源巨噬细胞中的炎症[20]。创伤-失血后引起的Ifi202b转录下调，可能与单核巨噬细胞分化、伤口愈合和骨髓来源巨噬细胞炎症的变化相关。

综上所述，作为干扰素刺激基因中Ifi家族基因的表达水平在创伤-失血后急剧下降，说明了Ifi相关基因在创伤-失血后的抗感染进程中可能起重要作用，具体机制有待进一步探究，靶向调控Ifi家族基因的表达可能为创伤失血后抗感染提供一种新的思路。

作者贡献声明:殷双琴、罗莉：研究实施、数据收集、论文撰写及修改、统计学分析；陈涛：实验实施、数据收集分析；梁星河、旷田垠、代伟宏：实验操作、论文修改；梁华平：研究指导、论文指导及修改、经费支持；朱俊宇：研究实施、数据收集、论文撰写及修改、统计学分析、经费支持