猴头菌固体发酵技术及其对发酵产物中生物活性物质影响研究进展

2023-02-01 01:26李昕阳陈长宝
中国酿造 2023年12期
关键词:猴头菌多糖基质

李昕阳,冷 悦,陆 珠,王 旭,陈长宝,王 欢*

(1.长春中医药大学 吉林省人参科学研究院,吉林 长春 130000;2.吉林省蔬菜花卉科学研究院,吉林 长春 130000;3.延边朝鲜族自治州农业科学院,吉林 龙井 133400)

猴头菌(Hericium erinaceus)隶属担子门(Basidiomycota)伞菌纲(Agaricomycetes)红菇目(Russulales)猴头菌科(Hericiaceae)猴头菌属(Hericium)[1],也称为猴头蘑、羊毛菌、猴头菇等[2]。我国猴头菌属共有4个种,除了猴头菌外还有3个近缘种:小刺猴头菌、假猴头菌和珊瑚状猴头菌[3]。猴头菌属于腐生菌,野生猴头菌多生长在阔叶树木的腐木和立木受伤处,主要分布于东北大兴安岭,西北天山和新疆阿尔泰山等森林茂密之地。猴头菌是我国著名的药食两用真菌,据《中国药用真菌》记载猴头菌性平,味甘,能利五脏,助消化,有滋补抗癌、治疗神经衰弱之功效[4]。另有大量临床数据表明,猴头菌在防治消化不良、慢性胃炎、胃溃疡等疾病方面疗效显著[5]。除此之外,国内还将猴头菌开发成饮品、饼干、冲剂等形式多样的食品和保健品,备受消费者青睐,具有广阔的消费市场和良好的发展前景。

固态发酵(solid-state fermentation,SSF)是指在固态基质原料上进行的微生物发酵过程[6],培养基底物以固态形式存在,不溶于水,为微生物提供了生长环境和所需的营养物质[7]。固体发酵技术在我国有非常悠久的历史,如酱油、食用醋、白酒等。随着现代生物技术的发展,发酵在人类生活的各个方面都得到了应用,近年来利用食用菌进行固态发酵的研究也逐渐增多,探究食用菌菌丝体的潜在价值也成了新的研究热点[6]。何斌[8]采用双向固体发酵工程技术,以灵芝为出发菌株,以丹参药材为发酵基质,对菌株适应性、菌质药效与安全性进行筛选和发酵工艺的优化,研究结果显示灵芝酸三萜的含量显著增高。李慧星等[9]使用山药和蛹虫草进行双向固体发酵,发酵过程中山药中的多糖、纤维素等糖类物质被蛹虫草利用转化出山药中原来不存在的多酚类和皂苷类物质,同时,山药作为菌质,经发酵后其抗氧化活性也显著提高。翟飞红等[10]采用姬松茸和双孢蘑菇对小米进行固态发酵,提高了小米的蛋白质质量和多酚含量。该文综述了猴头菌固体发酵技术,介绍发酵基质的选择和发酵条件的调控,并对猴头菌固体发酵产生的以猴头多糖类、黄酮类和二萜类为主的三类活性物质含量的变化及影响因素进行归纳整理和阐述分析,以期为猴头菌固体发酵技术的研究提供参考。

1 猴头菌固体发酵技术

液体发酵作为传统的发酵方式,具有发酵周期短、占地面积小等优点,但同时存在易污染、提取活性物质成本高以及废水处理等问题[11-12]。相比而言,固体发酵技术生产成本低经济效益高,此外,固体发酵可提供类似自然界发生微生物反应的环境,利于发酵物进行生物转化,产生丰富的生物活性物质[13]。

目前国内外针对猴头菌固体发酵技术方面的研究开展较少,国内主要聚焦于猴头多糖的药理活性及提取工艺优化等方向,亦或是作为一种药性基质对人参[14]、青稞[15]、玉米[16]等中药或作物的生物转化作用。国外则较为关注猴头菌素对消化系统及神经系统[17-18]的保护作用,尤其以猴头菌素A(erinacine A,Er A)对以帕金森、阿尔兹海默症等为主的神经系统老化[19-20]类疾病的改善作用。

1.1 发酵基质的选择

猴头菌固体发酵可选的培养基质种类繁多,包括大米[21]、糯米[22]、糙米[23]、玉米[13]、大豆粉[21]、木屑[24]、人参等[14],这些原料为微生物的生长提供碳水化合物、蛋白质、粗纤维、脂肪以及微生物和无机盐,为猴头菌发酵提供底物[7]。与单菌株发酵相比,混菌发酵可以发挥多种细菌和酶的综合作用,提高发酵效率、更丰富的发酵产物和更多的可能性,尤其是药用真菌和益生菌混合发酵[14]。

张新超等[21]选用燕麦、大豆、玉米、麸皮、大米、荞麦六种培养基对猴头菌进行固体发酵和抗氧化活性的研究。将发酵后生物量作为评价标准,以荞麦大豆培养基为猴头菌最佳发酵基质,研究结果表明,经发酵总多酚含量、内源性抗氧化物质超氧化物歧化酶活性都明显提高。张鹏等[22]对汉麻秸秆的添加量进行探讨,以期替代常规配方中的阔叶木屑来栽培珊瑚猴头菌,研究结果发现,与常规配方相比,当汉麻秸秆添加量为60%时,菌丝生长最旺盛、生长周期最短,生物学效率和粗蛋白含量最高。唐敏等[14]以猴头菌为发酵菌种,人参为药性基质进行双向固体发酵,探究发酵菌质组和药性基质组不同发酵时期的多糖、蛋白质含量和抗氧化能力的变化。研究结果表明,猴头菌与人参双向固体发酵后,菌质中活性物质的抗氧化能力得到明显提升。关于猴头菌基质的选择主要取决于目标产物的选择,若为扩大生产可选用汉麻秸秆、荞麦大豆等作为培养基;若为提高代谢产物的含量和抗氧化能力则可以选择人参、大米等基质。

1.2 猴头菌固体发酵条件的选择

影响猴头菌固体发酵的因素包括发酵时间、发酵温度、初始pH值、含水量、碳源氮源的选择及碳氮比等因素[7]。在微生物的生长过程中,温度对蛋白质合成酶和细胞活性以及代谢产物的合成都是非常敏感的,因此在固体发酵中温度的控制极其重要[25];不同发酵时段的活性物质含量各不相同,如Er A只存在于菌丝体中,所以发酵时间的选择也至关重要[27];除此之外,在固体发酵过程中,由于代谢活动的影响,发酵环境的pH值会随之发生一定的变化,既可以直接影响菌丝体生长,也可间接通过影响发酵基质的物理、化学和生物学特性进一步影响菌丝体的生长发育,具体表现在菌丝体的形态外观,物质代谢和产量等方面[25]。

1.2.1 发酵温度的选择

盛悦[16]利用玉米蛋白粉发酵猴头菌,在对培养基进行优化时将培养温度分别设定为23 ℃、24 ℃、25 ℃、26 ℃、27 ℃,以多糖产量和菌丝体生物量为评价指标,最终确定25 ℃为培养基的最适温度。杨彤等[26]以长白山野生珊瑚状猴头菌菌株作为研究对象,进行单因素试验得出,理想的pH为3.5~4.0,温度为20~22 ℃,在此基础上进行正交试验,发现温度对珊瑚状猴头菌的影响程度最大,最佳发酵温度为20 ℃。SUN S K等[23]为了测试猴头菌的最适生长温度,将接种有猴头菌菌丝的马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)平板分别在5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃下培养30 d,结果发现,最适温度为25 ℃。

在不同发酵基质、发酵时间、pH值等因素的影响下,猴头菌固体发酵的最适温度略有出入,但大部分情况下,20~25 ℃最适宜猴头菌生长,菌丝体生物量最高,当发酵温度低于15 ℃或超过30 ℃时,由于细胞活性和蛋白质合成受到抑制[16],菌丝的生长速度和生物量都会出现不同程度的降低和减少。

1.2.2 发酵时间的选择

盛悦[16]在利用玉米蛋白粉发酵猴头菌时对固体发酵的时间也进行了优化,将发酵时间分别设定为12 d、13 d、14 d、15 d、16 d,在最适培养温度、接种量、初始pH值以及已经优化的培养基配方的基础上对发酵时间进行优化,结果表明,发酵时间为15 d时菌丝的生物量和多糖产量均达到最高,分别为0.173 5 g/g、5.337 4 mg/g。SUN S K等[23]利用小麦固体发酵猴头菌,在此基础上研究发酵产生的活性物质对斑马鱼胚胎脑细胞的保护和修复作用。选择0、21 d、28 d、35 d、42 d、56 d对培养时间进行优化,结果表明,发酵至35 d时猴头菌中的粗多糖和粗三萜含量最高,分别可达15.65%和0.153%,发酵至56 d时Er A含量最高,为0.062%。PATOCKA J等[27]利用木屑、大米和玉米麸作为固体培养基对猴头菌进行发酵,以探讨猴头菌不同生长时期的生物活性物质含量。发酵时间分别设定为14 d、21 d、28 d,研究结果表明,发酵至14 d时麦角甾醇和猴头菌素C(erinacine C,Er C)含量最高,分别为3.54 mg/g 和1.23 mg/g。

综上,一方面,猴头菌的最佳发酵时间会受到不同培养基的影响;另一方面,最佳发酵时间也要根据目标发酵产物进行优化,不同的活性物质对发酵时间的要求不同,但一般发酵至15~20 d时,猴头菌生物量可达到最大。发酵时间过长菌体进入衰亡期[16],生物活性物质不再进行积累反而开始消耗,发酵时间过短菌体尚未进入成熟期,不论是菌丝生物量还是生物活性物质含量都达不到最大值。因此最佳发酵时间的选择要综合考虑到培养基配方、发酵条件、菌种活力以及目标产物的要求。

1.2.3 初始pH值的选择

张新超等[21]利用荞麦和大豆对猴头菌的固体发酵条件进行优化,将初始pH值分别设定为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,以发酵后基质的2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt,ABTS+)自由基清除率为评判标准,结果表明,初始pH值为5.0时ABTS+自由基清除率超过50%,为最佳初始pH值。盛悦[16]通过单因素试验将初始pH值设定为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,发现pH值在4.0~5.0之间时,随着pH值的增加,多糖产量、菌丝体生物量随之增加且增速较快,然而当pH>5.0时则相反。在此基础上开展正交试验,显示当pH值为5.5时,多糖含量和菌丝生物量均达到最高,分别为4.346 mg/g和0.133 g/g。杨彤等[26]在PDA培养基上培养珊瑚状猴头菌,采用10%NaOH溶液和10%HCl溶液将培养基的pH调节至3.0、3.5、4.0、5.0、6.0等5个梯度,根据菌丝的长速和长势以及培养基的性质,综合判断珊瑚状猴头菌丝生长的适宜pH,结果显示,当pH值为3.5~6.0之间时,猴头菌的生物量和菌丝量最高,且差异性较小。

综上所述,培养基的选择对最优初始pH值的选择影响较小,初始pH值的选择主要与真菌的习性有关,猴头菌偏好弱酸性培养基,由于发酵过程中会不断分泌有机酸,后期基质会呈现过度酸化,抑制菌丝的生长[25],因而最佳初始pH值一般控制在4.0~6.0之间,利于菌丝体的生长和生物活性物质的积累。

2 猴头菌固态发酵产物中生物活性物质的变化

猴头菌作为我国著名的药食两用真菌,富含蛋白质、氨基酸、多种矿物质和维生素等多种营养物质,除此之外还含有多糖[29]、肽类、萜类、甾醇类以及醇类等生物活性物质[30],对治疗慢性胃炎、胃溃疡及十二指肠溃疡都有显著效果[31],具有增强免疫[30]、降血糖[32]、延缓衰老[33]、促进神经发育[30]等多种生理功能,具有极高的研究价值和意义。

2.1 多糖类化合物

猴头菌多糖是著名的真菌多糖之一,由多种成分组成[29]。在抗炎、抗溃疡、抗氧化、提高机体免疫力等方面都有较好的功效。猴头菌多糖抗溃疡的机理在于它能增强胃黏膜屏障机能[29],对溃疡表面细胞起到再生和修复作用[34]。石祥生[35]研究结果表明,猴头菌多糖能够提高巨噬细胞的吞噬能力,增强自然杀伤细胞的活性,还发现猴头菌多糖有一定的免疫调节和免疫增强作用。贾冬舒等[36]研究发现,猴头菌多糖可以通过激活超氧化物歧化酶的活性抑制机体的氧化反应,从而达到抗衰老的功效。韩爱丽[32]研究发现,珊瑚状猴头菌通过抑制胆固醇合成降低血浆中的胆固醇,通过促进低密度脂蛋白受体阻止胆固醇从肠道吸收,促进胆汁酸合成的限速酶的有效表达来促进胆酸或胆固醇的排出。蔡杨星等[37]分别以菌草和木屑作为基质固体发酵猴头菌,试验结果表明,菌草栽培和木屑栽培的猴头菌,其多糖含量均在菌蕾期达到高峰,分别达到78.99 g/L和83.63 g/L,然而在成熟期和衰老期则呈现逐渐下降的趋势。盛悦[16]在利用玉米蛋白粉对猴头菌进行固体发酵时,对超声辅助提取工艺进行优化,经固体发酵和优化后多糖得率为5.84%,相对于传统热水浸提法,多糖得率提高了50.52%。乔莉[38]对固体培养基进行优化和筛选,最终选定玉米和薯渣作为猴头菌固态发酵的培养基质,同时对猴头多糖的提取工艺进行优化,提取率为2.504%,野生猴头菌的多糖提取率是经固体发酵的猴头菌的2倍。曲明清等[39]的研究显示,野生猴头菌子实体平均含量为(4.68±0.10)g/100 g,高于人工栽培猴头菌子实体多糖含量1.22%。朱伶俐等[40]研究表明,不同基质配方对猴头菌子实体多糖分子质量及分布较为相近,然而各组分所占比例间的差异则较为明显。这提示关于猴头菌固体发酵配方与产糖之间的关系仍需进一步明确。

猴头菌经固体发酵后猴头多糖含量的变化除了与发酵基质、发酵参数等有关外,还与提取工艺的水平有很大关系。因此,关于猴头菌固体发酵技术和猴头多糖的提取技术仍需改进与优化。

2.2 黄酮类化合物

黄酮类化合物是植物的次生代谢产物,种类繁多,结构复杂[41],基本母核为2-苯基色原酮[42]。黄酮类化合物因其独特的化学结构对人类的肿瘤、衰老、心血管病等退行性疾病的治疗和预防有着重要的意义[43]。除此之外,还有大量研究表明,黄酮类化合物有提高动物机体抗氧化及清除自由基的能力[44]。喻凯[45]研究表明,猴头菌中的黄酮类化合物有抗胃肠道肿瘤的作用,在有效部位含有多种不同黄酮,在抗肿瘤的过程中发挥重要作用。INANAGA K[46]研究显示,猴头菌中提取出的杏仁烯酮可以通过血脑屏障,诱导神经生长因子合成,抑制β-淀粉样肽的细胞毒性,以及抵抗神经细胞由于氧化和内质网应激而导致的死亡。马贺等[15]在用青稞固体发酵猴头菌时发现,游离态黄酮含量呈现先降后升再降的波动变化,而结合态黄酮和总黄酮含量则相反,呈现先升后降再升的表现。猜测可能与发酵过程中猴头菌对游离态黄酮的酶解和利用有关。王世新[43]利用沙棘固体发酵猴头菌,对配方进行优化后测定该配方的猴头菌黄酮含量为7.42 mg/g,相比对照而言,提高了37.64%。张新超等[21]选用燕麦、大豆、玉米、麸皮、大米、荞麦6种基质对猴头菌进行固体发酵,结果发现,荞麦大豆混合培养基为最佳发酵基质,发酵后总黄酮物质含量为87.13 μg/g,与发酵前相比,总黄酮含量呈现下降状态,可能与猴头菌生长代谢有关。这与马贺等[15]研究结果相反,可能与发酵基质的选择和发酵时间的控制有关。综上,关于猴头黄酮的含量与固体发酵之间的关系仍需进一步探寻,包括猴头菌开始酶解利用黄酮类物质的界点和猴头菌酶解和利用黄酮类物质的机理。

2.3 二萜类化合物

二萜类物质由4个异戊二烯单位组成,在自然界中存在较少。AYER W A等[47]研究发现,发酵鸟巢菌科黑蛋巢菌属非洲黑蛋巢菌的营养液中存在显著抑菌作用的生物活性物质,是一种具有二萜骨架鸟巢烷型碳架的二萜类物质,而猴头菌素是典型的一类拥有二萜骨架鸟巢烷型碳架类型的二萜类物质,可促进神经生长因子(nerve growth factor,NGF)的合成。目前可从猴头菌菌丝体中分离出15种猴头菌素(猴头菌素A~K,P~S),其中8种具有不同的神经保护特性,如增强NGF释放(猴头菌素A~I),减少β-淀粉样蛋白沉积等。然而,目前还没有直接证据表明这些化合物可以通过血脑屏障[35],Er A是唯一一种专门用于将体外研究结果与体内研究结果相关联的化合物[36]。LEE K F等[48]研究发现,在缺血性脑损伤后,Er A通过发挥活性氧清除剂的作用抑制p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和CCAAT增强子结合蛋白(enhancer binding protein,EBP)同源蛋白活化,保护神经元免受缺血损伤而死亡,具有神经保护和清除自由基的能力。Er C在星形胶质细胞中具有有效的神经营养因子诱导特性。RASCHERM等[49]研究发现,Er C诱导的神经营养活性通过原肌球蛋白受体激酶A(tropomyosin receptor kinase A,TrkA)受体及其相关的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinases,PI3K)、磷脂酰肌醇-2激酶(phosphatidylinositide 2-kinases,PI2K)途径和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途径介导人前列腺癌细胞分化,同时能诱导ETS转录因子转化特异性共识转录,独立于神经营养蛋白的诱导,这一发现有助于解释猴头菌素类化合物的多效性功能。乔莉[38]研究表明,猴头菌素S(erinacine S,Er S)可诱导胃癌细胞中活性氧积累导致细胞凋亡,但在正常细胞中则不然。同时,在体内异种移植的小鼠模型也显示出其对肿瘤生长的抑制作用,据免疫组学分析显示,Er S可以显著增加Fas受体和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关的凋亡诱导配体蛋白,从而降低胃癌异种移植小鼠中增殖细胞核抗原和细胞周期蛋白D1的水平。综上,猴头菌素作为二萜类化合物的代表性物质,在保护神经系统和抗肿瘤方面意义显著,具有极高的研究价值和临床意义。CHANG C H等[50]在500 L反应器中培养猴头菌,在培养基中加入葡萄糖、酪蛋白胨、NaCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl2、CuSO4·5H2O、ZnSO4、Mn(NO3)2、Ni(NO3)2,发现猴头菌的生物量和Er A的产量分别达到16.8 g/L和(225±54)mg/L,均得到明显提升。CHENG P Y等[51]对6种培养基质进行筛选,结果发现,玉米粒为最佳培养基质,此外,还发现在培养基中加入NaCl或ZnSO4可使Er A的产率显著提高至120.97 mg/g和165.36 mg/g。Er A只存在于菌丝体中,因此需要对猴头菌的发酵时间做到严格把控。WOLTERS N等[52]在糖蜜培养基上固体发酵猴头菌,根据不同培养基组分对Er C产生的抑制作用进行修饰,在培养基中添加硫酸铵、碳酸钙、葡萄糖以及燕麦片。并对氮源对Er C含量变化的影响进行探究,最后选择酪蛋白作为最佳氮源进行固体发酵,结果显示Er C含量达到2.73 g/L,比现有文献提到的浓度高10倍以上。除此之外,根据多位学者[50-52]研究表明,在培养基中添加无机物或微量元素进行发酵有益于猴头菌素含量的增加,因而,关于影响发酵后猴头菌素含量的因素可从发酵时间和培养基添加物及添加物的多少等方向展开研究。

3 结论

猴头菌作为名贵的药食两用真菌,因其极高的营养价值和药理活性,受到广大消费者的青睐,市场需求日益旺盛。猴头菌经固体发酵可产生多种活性物质,其中以多糖类、黄酮类和二萜类化合物为主的生物活性物质有着极高的药用价值和研究意义。猴头多糖目前在临床被广泛应用于治疗急慢性胃炎、萎缩性胃炎、消化不良等消化系统炎症,此外,对消化系统肿瘤亦有良好疗效。以猴头菌素为主的二萜类化合物因其良好的神经保护作用和抗氧化活性被广泛应用于研究神经系统疾病,如治疗阿尔茨海默症、帕金森等神经系统退行性病变。在固体发酵技术因其独特的优越性也越来越受到行业的关注。

目前关于猴头菌的开发利用面临以下难题:猴头菌固体发酵基质的选择和发酵条件的优化;猴头菌固体发酵与生物活性物质之间关系的研究尚不明确;猴头菌素直接通过血脑屏障及对神经系统保护作用的药理机制尚不明确等。因此,猴头菌的开发利用受到严重限制,针对猴头菌资源开发利用目前面临的困境和难题,建议进一步探索和优化固体发酵技术,以便对猴头菌进行更深层次的开发利用、开拓更为广阔的市场以及积极投入临床治疗,为猴头菌资源的开发利用打开新局面。

猜你喜欢
猴头菌多糖基质
机插秧育苗专用肥——机插水稻育苗基质
金银花扦插育苗基质复配及验证
不同栽培基质对一品红扦插苗的影响
米胚多糖的组成及抗氧化性研究
熟三七多糖提取工艺的优化
猴头菌素A2种包合物制备工艺的优化及其稳定性
猴头菌片对大鼠急性酒精性胃黏膜损伤的保护作用及其机制
RP-HPLC法同时测定猴头菌片中5种核苷
直干蓝桉容器育苗基质的选择
猴头菌颗粒联合泮托拉唑治疗消化性溃疡78例临床疗效