ADAMTS7在人胃癌中的表达及临床意义

汪虎，李靖，谢波，张晨嵩，潘成武，张新鑫，王辉，贾建光

在全球范围内，胃癌(gastric cancer, GC)是第四大常见癌症，也是导致癌症相关死亡的第二大主要原因[1- 2]。尽管胃癌的发病机理和分子生物学机制处于不断研究中，但是外科手术治疗仍然是目前胃癌的唯一根除疗法，大部分的胃癌患者因在确诊时即为进展期，且肿瘤较早发生转移，而丧失最佳治疗时期。尽管晚期胃癌的化疗方案取得了进展，如5-FU方案和铂方案，但总生存期(OS)仍不理想。近年来，各种靶向药物被开发出来，然而，总体结果仍然令人失望。生物信息学为胃癌的治疗带来了希望。有必要利用生物信息学方法开发有价值的生物标志物，并预测靶向治疗的效果。因此，为早期筛查和诊断选择新的生物标志物一直是胃癌一级预防和治疗的紧迫策略。

图1 ADAMTS7在多种类型组织中的mRNA表达(TCGA数据集)

含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶7(ADAMTS7)是具有血小板反应蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS)家族的成员。近年来，随着研究的发展，许多报告已经确定了ADAMTS7蛋白在各种发育组织(包括癌症)中的功能[3-5]。但是ADAMTS7与胃癌相关性联系鲜有报道，本研究中，使用综合生物信息学分析TCGA数据库数据来确定ADAMTS7在胃癌中具有预后价值。

1 资料和方法

1.1 ADAMTS7基因在泛癌组织中的表达 应用R 语言分析软件ggplot2包，将ADAMTS7在各种肿瘤组织中的表达水平进行综合比较[6]。

1.2 ADAMTS7基因在胃癌中表达 应用R软件BiocManager及limma包提取目的基因表达数据,并利用Perl软件提取目的基因在胃癌组织及其对应正常胃组织中的表达数据。然后,应用R软件对目的基因表达数据及配对数据进行可视化[7-8]。其中在非配对样本中，癌组织375例，正常组织32例。在配对样本中，癌组织27例，癌旁组织27例。

1.3 预测ADAMTS7对胃癌的诊断价值 应用R软件pROC及ggplot2包以ADAMTS7的表达量作为诊断胃癌的指标绘制ROC。

1.4 临床病理特征的独立预后分析 利用Perl软件将临床病理特征与目的基因表达进行整合后获得独立预后分析输入文件,利用R软件survival及survminer包)对输入文件进行单因素及多因素Cox回归分析，同时利用R软件对相关数据进行生存分析。使用N分期、年龄、肿瘤残留和ADAMTS7水平利用R软件rms及survival绘制列线图、ROC曲线、生存率校准曲线[9]。

1.5 目的基因富集分析 利用R软件clusterProfiler包及GSEA方法来识别2组给定样本间差异富集的基因和途径。首先根据基因与ADAMTS7表达的相关性生成一个基因列表，并根据样本队列中ADAMTS7的中值水平将患者数据集分为ADAMTS7高表达组和低表达组。每次分析总共进行1 000个基因集排列。根据标称P值和标准化富集分数(NES)确定富集途径并进行分类[10]。

2 结果

2.1 ADAMTS7在多种类型组织中的mRNA表达 TCGA数据库分析结果显示，在33种肿瘤组织中，15种类型肿瘤中ADAMTS7表达水平高于正常组织(P<0.05)，其余18种类型肿瘤中ADAMTS7表达水平与正常组织的表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.2 ADAMTS7在胃癌中的表达状况 TCGA数据库显示，在胃癌非配对样本中，ADAMTS7基因在癌组织中表达水平高于正常组织，差异有统计学意义(P<0.05),见图 2A；在胃癌配对样本中，ADAMTS7癌组织中表达水平高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见图 2B。

2A 非配对癌组织表达情况 2B 配对癌组织表达情况图2 ADAMTS7在胃癌中的表达状况

2.3 预测ADAMTS7对胃癌的诊断价值 为了预测ADAMTS7对胃癌的诊断价值，本课题组以ADAMTS7的表达量作为诊断胃癌的指标绘制ROC曲线，曲线下面积(AUC)0.858(95%CI: 0.799～0.918)。ADAMTS7作为诊断胃癌的指标具有一定的准确性，可能作为预测胃癌的潜在标志物。见图3。

2.4 ADAMTS7的表达与胃癌患者预后的关系 在 TCGA数据库中，生存分析表明，ADAMTS7高表达患者具有较差的总生存率OS(P=0.007)以及较差的疾病特异生存率DSS(P=0.038)。见图4A和4B。对数据库中缺失数据删减后行单因素Cox回归分析显示ADAMTS7高表达、T3期、T4期、N1期、N3期、M1期、病理分期Ⅱ～Ⅳ期、年龄大于65岁及残余肿瘤是胃癌生存较差的预后因素，而多因素Cox回归分析显示ADAMTS7高表达、N3期、年龄大于65岁及残余肿瘤是胃癌生存较差的预后因素。见表1。

图3 预测ADAMTS7对胃癌的诊断价值

4A ADAMTS7表达的OS生存曲线 4B ADAMTS7表达的DSS生存曲线图4 ADAMTS7表达的OS和DSS生存曲线

表1 ADAMTS7单因素和多因素分析

2.5 基于ADAMTS7表达构建列线图及验证预后影响 使用N分期、年龄、肿瘤残留和ADAMTS7水平作为预测胃癌患者1、3、5年OS的指标构建列线图(图5A)。ROC曲线评估列线图的判别度，1、3、5年AUC分别是0.512、0.605和0.657(图5B)。校准曲线呈现了1、3、5年临床结果列线图的理想预测(图5C)。综合上述数据表明，ADAMTS7可作为预测胃癌患者OS的有用生物标志物。

2.6 基因集富集分析 通过GSEA确定 ADAMTS7在胃癌中作用的推定细胞机制，结果表明MAPK信号通路和 Hedgehog信号通路是ADAMTS7 高表达表型中差异丰富的途径。见图6A、图6B。

5A 列线图 5B ROC曲线 5C 校准曲线图5 基于ADAMTS7表达构建列线图及验证预后影响

图6 基于GSEA的ADAMTS7相关信号通路GSEA富集分析

3 讨论

胃癌是常见的消化系统肿瘤之一，也是全球致命的一种肿瘤。目前，手术切除是早期胃癌患者的主要治疗方法，而化疗是晚期胃癌患者的首选治疗方法[11-12]。然而，鉴于症状是非特异性的，大多数胃癌患者被诊断为晚期。因此，确定一种敏感且特异的生物标志物来预测胃癌的预后并作为胃癌治疗的靶点至关重要。研究[13-14]表明，随着多种分子生物学和基因技术的进步，如高通量测序，为研究胃癌的分子机制提供了新的选择，并且发现了各种新的靶点[15-17]。

表观遗传学(epigenetics)是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达可遗传变化的一门遗传学分支学科。表观遗传学包含DNA甲基化、染色质可及性与染色质构象和非编码RNA的转录后修饰与组蛋白翻译后修饰等。近年来，在各个疾病领域，表观遗传学的研究越来越多，结合生物信息学技术以及多组学技术，可用来捕获不同生物过程的基因表达与表观遗传改变的相关性。以上这些技术的应用也正迅速成为细胞可塑性和多样性研究的有力工具，可着眼于癌症、干细胞等早期的表观遗传学变化，对于理解病因、早期诊断及晚期控制等方面具有极高的价值，为基因调控和疾病预后提供了有价值的见解。

ADAMTS7是ADAMTS家族的蛋白水解成员，该家族包括一个信号肽、一个前域、一个金属蛋白酶结构域、一个类分离素结构域和几个血栓反应蛋白I型重复序列(TSP1)，由间隔域分隔[18]。用转化酶(furin或类似furin的酶)裂解ADAMTS前肽是酶活化的典型要求。例如，与PACE4、PC6B和PC7转化酶相比，furin是ADAMTS7成熟所需的主要转化酶。α2-巨球蛋白(α2M)与ADAMTS7结合，是ADAMTS7的新底物，而ADAMTS7的金属蛋白酶结构域是α2M裂解所必需的。已知ADAMTS家族由19种蛋白酶组成，这些酶在发育、血管生成和凝血中起重要作用，其失调和突变与许多疾病过程有关，如炎症、癌症、关节炎和动脉粥样硬化[19]。如ADAMTS7形成了自己的亚群具有独特的特性。有证据[20-21]表明，ADAMTS-7可能在骨关节炎的发病机制中发挥关键作用。一项研究[22]发现，ADAMTS7在关节炎软骨和滑膜中显著上调，虽然在类风湿性关节炎患者的软骨中ADAMTS7均显著上调，但在骨关节炎患者中却没有显著差异。可见，ADAMTS7在其他疾病中表达存在差异，这些都为我们研究ADAMTS7在胃癌中的作用提供了理论基础。

然而，ADAMTS7在先前的癌症研究中鲜有报道，本课题组发现ADAMTS7在胃癌中起作用。本研究通过分析TCGA数据库胃癌的基因表达数据及临床数据，结果显示ADAMTS7不论是在非配对样本中还是在配对样本中，其在癌组织中的表达均明显上升。以ADAMTS7的表达量作为诊断胃癌的指标绘制ROC，AUC为0.858，其具有一定的准确性。生存分析表明，高ADAMTS7表达具有较差的OS以及较差的DSS。单因素COX回归分析显示ADAMTS7高表达、T3期、T4期、N1期、N3期、M期、年龄大于65岁及残余肿瘤是胃癌生存较差的预后因素，而多因素COX回归分析显示ADAMTS7高表达、N3期、年龄大于65岁及残余肿瘤是胃癌生存较差的预后因素。为了进一步预测ADAMTS7在胃癌中的作用机制，利用GSEA富集分析进行预测，结果表明MAPK信号通路和 Hedgehog信号通路是 ADAMTS7 高表达表型中差异丰富的途径。这些结果表明ADAMTS7在胃癌中高表达，可能通过MAPK信号通路和Hedgehog信号通路影响胃癌的预后，其可能是胃癌的新的诊断指标。

综上所述，本研究通过生物信息学方法和大数据分析从不同层面诠释了ADAMTS7在胃癌中的表达及其临床意义。即ADAMTS7的高表达水平在胃癌发生发展过程中可能起着重要作用，有望成为胃癌诊治和预后判断的重要指标和新的靶点。但生物信息学方法同样存在着局限性，仍然需要更多的相关实验数据进行证实。