翘嘴鳜mtf-1表达特征分析及镉胁迫对其节律性表达的影响

潘亚雄 周 俊 张 宇 陶晋升 潘佳琳 唐昭阳 樊轶为 胡名广李慧菊 张建社 褚武英

(1.长沙学院生物与环境工程学院, 长沙 410022; 2.盐城工学院海洋与生物工程学院, 盐城 221051)

金属硫蛋白(Metallothioneins, MTs)基因参与了鱼类对水体重金属胁迫下的解毒反应, 它通过与细胞内重金属结合, 降低游离重金属离子浓度从而降低重金属的毒性, 其基因表达的精准调控对鱼类抵抗重金属毒性具有重要意义。金属调节转录因子-1 (mtf-1)是金属诱导MTs基因表达调控的关键转录因子[1], 其通过与MTs基因启动子上的金属响应元件(Metal-responsive elements, MREs)的结合, 进而调控MTs的表达。mtf-1属于核质穿梭蛋白, 在细胞未受到外界刺激的条件下, 大部分mtf-1存在于细胞质中, 当细胞受到重金属胁迫时, 它会积聚到细胞核中, 与基因启动子上的MREs元件结合, 通过激活MTs等靶基因的转录, 在重金属的解毒、氧化应激的保护等生理过程中发挥重要作用[2—4]。mtf-1基因序列高度保守, 在小鼠(Rattus norvegicus)、人类(Homo sapiens)、果蝇(Drosophila melanogaster)、斑马鱼(Danio rerio)和水豚(Hydrochoerus hydrochaeris)等多个物种中均被鉴定研究[5], 其蛋白质序列包含一个高度保守的DNA结合域和一个由三种转录激活域组成的反式激活域, 3种转录激活域分别为酸性、脯氨酸和富含丝氨酸/苏氨酸的区域[6]。关于mtf-1功能的研究主要集中在哺乳动物[7,8], 小鼠肝脏敲低mtf-1基因后对重金属的耐受性大大减弱,mtf-1参与了哺乳动物谷胱甘肽合成等抗氧化通路的调控[9],mtf-1基因在鱼类的研究相对较少[1,10,11]。

镉是一种生物非必需的有毒重金属, 由于生物半衰期长, 即使是较低的浓度, 也容易在生物体内蓄积, 进而导致器官损伤等毒性作用。鱼类作为长期生活在水中的低等脊椎动物, 直接与水体中的重金属接触, 对镉具有较高的敏感性[12]。镉在鱼类中主要通过鳃和胃肠道的吸收, 在鳃、肝脏和 肾脏等器官中持续蓄积, 进而导致鱼类器官损伤, 代谢紊乱等毒性效应[13]。近年来, 越来越多的研究表明镉会对生物体的昼夜节律产生毒性干扰, 其通过扰乱脑组织核心生物钟基因节律性表达, 进而导致生物代谢紊乱, 氧化应激损伤等[14—16]。与哺乳类一样,鱼类活动也具有稳定的昼夜节律性, 我们前期在翘嘴鳜中克隆得到了与哺乳类同源的全部核心生物钟基因(CLOCKs、BMAL1、PERs、CRYs、RORs和REV-ERBs等), 证实了翘嘴鳜和哺乳类一样, 具有同样的由核心生物钟基因振荡调控的昼夜节律性机制[17]。mtf-1作为细胞对重金属响应和MTs基因表达的重要调节因子, 其是否介导了重金属镉的节律毒性效应还并未有研究。

翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)是中国特有的淡水名贵鱼类, 被广泛养殖[18]。但翘嘴鳜对水质要求较高,对水体环境污染的耐受性差, 易受水质影响而导致存活率较低[19]。本研究鉴定得到翘嘴鳜mtf-1的cDNA全长序列, 对其组织表达模式及序列特征进行了分析, 并研究了其在翘嘴鳜脑组织中的昼夜表达特征, 及镉对翘嘴鳜mtf-1昼夜节律的影响, 为探究重金属镉对鱼类生物节律毒性效应提供了资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验翘嘴鳜均从长沙市望城区团山湖村翘嘴鳜养殖场购入, 翘嘴鳜平均体重为 200 g, 将翘嘴鳜置于室内实验基地进行养殖, 所有鱼每天在早上9:00和下午5:00饱食投喂饵料鱼2次, 保证实验鱼的生物周期性一致。翘嘴鳜首先在LD光制(12h光照/12h黑暗)下驯养2周, 在驯养结束后, 进行正式实验,养殖用水为已曝气去氯的自来水。实验中所用的镉为CdCl2·2.5H2O, 购自上海国药控股有限公司。通过一定比例将CdCl2·2.5H2O和蒸馏水混合配制为原液, 保存待用。

1.2 实验方法

组织表达实验鱼的养殖及样本的收集采购的翘嘴鳜用12h光照/12h黑暗的LD光制驯养两周, 待翘嘴鳜状态稳定, 禁食24h后, 选取规格一致、健康的翘嘴鳜6尾(雌雄鱼比例1﹕1)进行取样。用100 mg/L MS-222(3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸)对鱼进行麻醉, 然后放置在冰上解剖, 快速取其肠道(中肠)、肝脏、脑、肾脏、脾脏、心脏、鳃和肌肉(背肌上的白肌)8个组织, 置入无RNA酶EP管中, 液氮速冻后, 放入–80℃冰箱保存备用。

镉胁迫实验鱼的养殖及样本的收集采购的翘嘴鳜分为正常组和胁迫组两个处理组, 随机放入6个50 cm×50 cm×90 cm的室内玻璃缸中, 用12h光照/12h黑暗的LD光制驯养两周, 在驯养结束后, 进行时期两周的镉胁迫养殖。在此期间, 每天提供持续通气, 保证溶氧充足。每天早上9:00和下午5:00饱食投取饵料鱼2次、0.5h后清理剩余饵料鱼和粪便、用已曝气去氯的自来水换取缸中30%的水。镉胁迫组换的水中要溶入适量的CdCl2原液,经稀释后加入缸中, 保持水体中的Cd浓度在20 μg Cd/L。用pH测定计分别测定缸中pH, 使pH维持在7.2—7.4、水温(24±1)℃。两周胁迫结束, 翘嘴鳜禁食24h后开始取样。取样时间节点分别是06:30(ZT0)、09:30(ZT3)、12:30(ZT6)、15:30(ZT9)、18:30(ZT12)、21:30(ZT15)、24:30(ZT18)、次日03:00(ZT21)和次日06:30(ZT24), ZT0表示每天光照开始的时间。每个时间点随机选取3尾鱼, 用100 mg/L MS-222对鱼进行麻醉, 然后放置在冰上解剖, 快速取脑组织, 置入无RNA酶EP管中, 液氮速冻后, 放入–80℃冰箱保存备用。

总RNA的提取以及cDNA的合成冷冻的组织样品放入已加研磨珠和1 mL RNAios Plus的无酶EP管中, 使用高速匀浆仪匀浆。后续步骤参照TaKaRa的RNAiso Plus说明书进行。为验证总RNA浓度和纯度, 采用超微量核酸蛋白分析仪对其进行测定。总RNA的完整性通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 当28s与18s条带亮度为2﹕1且条带清晰可见时, 表明提取的RNA具有较高的完整性。取1 μg的总RNA采用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒进行逆转录。合成的单链cDNA收集保存至–80℃供后续分析。

引物合成及序列分析采用Primer 5.0软件设计qPCR引物, 并送擎科生物有限公司合成(表1)。采用Megalign v7.1.0软件对翘嘴鳜mtf-1与其他物种的同源性进行分析。使用bioedit v7.2.5默认设置的ClustalW程序进行多序列比对, 再通过GeneDocv6中文版进行优化编辑, 得到序列比对结果。使用JASPER 2022(https://jaspar.genereg.net)转录因子预测数据库对翘嘴鳜mtf-1基因转录起始位点上游2 kb区域进行转录因子结合位点预测。

表1 定量引物Tab.1 Quantitative primers

实时荧光定量PCR通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测基因表达量。在RT-qPCR分析中, 每个样品检测3个技术重复。RT-qPCR的反应总体系一共为25 μL, 反应成分为SYBR Premix ExTaqTMⅡ 12.5 μL, cDNA 1 μL, 上下游引物各为1 μL,ddH2O 9.5 μL。qPCR条件为: 95℃预变形1min;95℃变性5s; 58℃退火、延伸30s; 39个循环; 溶解温度在65—95℃。组织表达实验以rpl-13为内参,节律分析实验以β-actin为内参。

1.3 数据处理及分析

所有数据以mean±SE表示。荧光定量PCR采用2–∆∆Ct方法计算基因的相对表达量。采用SPSS 20.0软件进行统计分析, 利用单因素方差分析(Oneway ANOVA)和Tukey’s multiple comparisons test比较不同组织之间的差异,P<0.05水平下差异显著。翘嘴鳜脑组织mtf-1基因的昼夜节律通过SPSS 20.0独立样本t检验进行显著性分析后, 采用matlab 7.0通过函数方程式f(t)=M+Acos(t/12-φ)对定量数据进行余弦拟合。方程中f(t)给定时间内基因表达水平; M为平均值; A为振荡振幅;φ为峰值相位, 即最高振幅所在时间点换算出的角度。当不同时间点基因表达量单因素方差分析显著性差异P<0.05和余弦拟合P<0.3时, 则视该基因具有昼夜节律性[20,21]。

2 结果

2.1 mtf-1基因氨基酸序列比对及同源性分析

翘嘴鳜mtf-1cDNA全长为2758 bp, 由816个氨基酸组成。氨基酸比对结果表明, 翘嘴鳜mtf-1具有一个典型的DNA结合域和一个反式激活域(包括:酸性、脯氨酸和丝氨酸/苏氨酸丰富区域), 以及核定位信号(NLS)和核输出信号(NES) (图1), 其中DNA结合域高度保守, 反式激活域区域高度可变。mtf-1氨基酸序列同源性分析表明, 翘嘴鳜mtf-1与其他物种具有较高的序列同源性, 其中与斑马鱼mtf-1基因同源性为77.1%, 与人类mtf-1基因同源性为56.8%, 表明在进化中不同物种mtf-1趋向保守。

2.2 mtf-1上游转录因子结合位点预测

对翘嘴鳜mtf-1基因转录起始位点上游2 kb序列进行转录因子结合位点预测分析, 鉴定得到多个重要转录因子结合位点(图2), 如核心时钟基因类视黄醇相关孤儿受体β(RORβ)、MAF蛋白家族中的MAFF和MAFG、锌指转录因子Klf4以及多种锌指蛋白结合位点等, 但翘嘴鳜mtf-1基因启动子区域并未找到金属响应元件(MRE)。

图2 翘嘴鳜mtf-1基因5′上游2 kb区域预测的转录因子结合位点的示意图.Fig.2 Schematic representation of predicted putative transcription factor binding motifs in the 2 kb region upstream of the 5′-upstream of the Siniperca chuatsi mtf-1 gene.

2.3 mtf-1基因的组织表达

为了研究翘嘴鳜mtf-1基因在不同组织中的表达水平, 对8个不同组织(心、肝、脾、肾、鳃、肠、脑和白肌)的cDNA进行半定量PCR(RTPCR)及实时荧光定量PCR ( RT-qPCR ) 检测(图3),翘嘴鳜mtf-1在所检测的组织中均有表达, 其在脑组织中表达量最高, 其次是肾脏以及心脏组织, 在肠道、鳃、肌肉和肝脏中低表达, 实时荧光定量PCR分析和半定量PCR两种不同检测方法, 检测结果相似。

图3 mtf-1在翘嘴鳜不同组织的表达水平Fig.3 Expression levels of mtf-1 in different tissues of Siniperca chuatsi

2.4 mtf-1基因在脑的昼夜节律表达分析

采用实时荧光定量对翘嘴鳜脑组织中mtf-1基因24h昼夜节律表达进行分析, 并使用matlab分析其昼夜节律性, 结果表明mtf-1基因在正常组的翘嘴鳜脑中表现出昼低夜高的表达趋势, 其表达峰值对应的时间点为ZT=12.65(黄昏时期; 表2), 镉胁迫后,mtf-1基因呈现持续低表达, 昼夜表达差异不显著,且在多个时间点表达量均低于对照组(图4), 表明重金镉抑制了翘嘴鳜脑组织mtf-1基因表达, 并导致翘嘴鳜mtf-1表达由昼低夜高变为昼夜持续低表达。

图4 镉胁迫对翘嘴鳜脑组织mtf-1基因的节律表达Fig.4 The effect of cadmium on rhythmic expression of mtf-1 gene in the brain of Siniperca chuatsi

表2 翘嘴鳜脑mtf-1基因的节律性参数Tab.2 Rhythmical parameters of mtf-1 gene in brain of Siniperca chuatsi

3 讨论

转录因子mtf-1协调MTs基因的表达, 对于降低重金属对机体的毒性作用有重要意义。翘嘴鳜mtf-1由816个氨基酸组成, 只有1个mtf-1亚型, 与绝大多数哺乳类和鱼类只有1个mtf-1亚型一致, 但在大西洋鲑和鲤中发现2个以上mtf-1亚型, 这可能是由于鲤科鱼类和鲑科鱼类特有的全基因组倍增所导致[23,24]。翘嘴鳜mtf-1序列包含1个DNA结合域和3个不同的激活域(富含酸性氨基酸的区域、接着是富含脯氨酸的区域以及富含丝氨酸/苏氨酸的区域), 此外还有核定位信号(NLS)和核输出信号(NES), 与哺乳类mtf-1基因功能域结构高度一致。序列同源性分析发现翘嘴鳜mtf-1氨基酸序列与斑马鱼mtf-1基因同源性为77.1%, 与人类mtf-1基因同源性为56.8%, 虽然翘嘴鳜mtf-1序列与哺乳动物mtf-1序列保守性不高, 但其DNA结合区域却与哺乳类mtf-1基因DNA结合域高度相似, 说明翘嘴鳜mtf-1基因可能与哺乳类mtf-1基因调控相似的靶基因表达。

组织表达分析表明翘嘴鳜mtf-1在所检测的各个组织均有表达, 其中在脑、肾脏及心脏中具有较高表达。鲤中的研究也发现mtf-1基因在脑组织中最高表达[12], 与本研究结论相似。研究表明mtf-1对中枢神经系统组织的发育是不可缺少的[25], 此外,小鼠中的研究发现mtf-1还对小鼠胚胎肝脏的正常发育和功能尤为重要[26,27], 表明mtf-1在机体发育过程中发挥着重要的作用。我们对翘嘴鳜mtf-1的5′上游区域转录因子结合位点进行预测, 在翘嘴鳜mtf-1启动子上鉴定到多个转录因子靶向位点, 包括锌指蛋白ZNF136、ZNF384、ZNF143、RORβ、MAFF、MAFG和SPIC等。类视黄醇相关孤儿受体β(RORβ)核心生物钟基因, 在生物的昼夜节律维持中发挥着重要的作用[28]。锌指蛋白(ZNFs)是蛋白质中含量最丰富的一类, 它涉及转录调控、DNA修复、细胞迁移等众多过程[29]。研究表明, 在黄颡鱼和鲍等物种mtf-1启动子上存在MRE位点[1,30], 表明mtf-1存在自调节, 但在翘嘴鳜启动子上并没有发现MRE位点, 说明mtf-1自调节在鱼类中并不是普遍存在。

昼夜节律支配着大多数物种的休息/活动周期,并影响生物体代谢水平与周期变化[31]。大量研究表明, 重金属镉通过诱导氧化应激进而导致器官损伤, 代谢紊乱等毒性效应[32,33]。近期, 越来越多的研究也表明包括镉在内的重金属具有很强的内分泌毒性效应, 会通过影响脑垂体褪黑素等激素的分泌, 进而导致生物昼夜节律发生紊乱[34,35]。鱼类中的研究表明脑组织是水体重金属镉的重要毒性靶器官[36], 但关于重金属镉对鱼类昼夜节律影响的相关研究还较少。本研究发现水体镉胁迫导致翘嘴鳜脑组织mtf-1基因昼夜节律发生紊乱, 正常组mtf-1基因在翘嘴鳜脑组织中呈现昼低夜高的表达趋势,峰值对应区时ZT 12.65h, 在镉胁迫下,mtf-1基因相比正常组持续低表达, 基因表达峰值提前至 ZT 3.71h, 同时增幅减弱, 昼夜表达差异不显著。研究发现, 物质代谢和细胞稳态等都受生物节律调控,如肝脏中发现100多个代谢相关的基因呈现昼夜节律性变化, 扰乱生物节律则会导致代谢紊乱, 细胞损伤[37,38]。mtf-1作为重要的重金属解毒反应调控基因, 其脑组织基因表达昼夜节律紊乱将对镉毒性效应具有较大的促进作用。本研究也表明水体镉胁迫对鱼类脑组织具有昼夜节律毒性效应。