生物传感器概述及其在动物疫病检测中的应用

罗 娟，尚佳静，李 丹，石慧花，张富友，于晓慧，邓春冉，刘华雷，刘冠慧，李 阳

（1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3.山东医药技师学院，山东泰安 271016；4.上海市奉贤区动物疫病预防控制中心，上海 201400）

近年来，随着我国畜牧业的不断发展，动物疫病呈现一定的上升趋势。尽管疫苗和生物安全措施能够对动物疫病起到一定的防控作用，但动物疫病一旦发生，会对动物健康、动物源性食品安全、人民健康及生态环境造成一定影响。因此，建立行之有效的动物疫病检测技术，及早准确发现疫病，对于控制动物疫病的进一步传播，促进畜牧业稳定健康发展，保护人类健康安全具有重要意义[1-2]。目前用于动物疫病检测的技术主要有病原分离与培养、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光试验（IFA）和聚合酶链式反应（PCR）等[3-4]，但是这些传统的诊断技术对操作人员和仪器要求较高，信号读取和检测所需时间较长，因而不利于疫病的早期诊断。

生物传感器是由生物敏感元件与换能器件组成的分析装置，能够与生物特异性结合，产生与反应中分析物浓度成比例的可测量信号，具有稳定性好、灵敏度高、选择性强的特点。近年来，生物传感器被广泛应用于医疗、农业、环境监测和食品等行业[5]，在兽医领域的应用也不断增加。随着动物疫病诊断技术的不断发展，生物传感器作为即时检测、长期监测动物疫病的设备，逐渐成为众多研究者关注的热点。本文通过阐述生物传感器的原理、分类及在动物疫病检测领域的应用，以期为生物传感器在相关领域的进一步开发应用提供理论支撑。

1 生物传感器组成及原理

生物传感器这一概念最早于1962 年由Clark团队[6]提出，他们将葡萄糖氧化酶（GOD）固定化后与氧电极组装在一起，开发了一种用于葡萄糖检测的氧化酶电极。这项研究为生物传感器发展开启了新篇章[7]。

生物传感器由被分析物、分子识别元件、换能器、电子处理器及显示器五部分组成[8-9]，其中分子识别元件和换能器是最重要的两个部分。分子识别元件又称敏感元件，一般为生物受体，能够有效识别被分析物的分子，可分为经典识别元件（酶、组织、细胞、DNA 和抗体等）和新型识别元件（脱氧核酶、亲和体、噬菌体、核酸适配体以及分子印迹聚合物等）；换能器又称信号转换器，可以将生物分子识别后产生的信号转化为等量的可视或可读信号，从而对目标物进行定量分析[7]。

生物传感器工作原理[7，10]：待测物质经扩散作用进入分子识别元件，经分子识别作用与分子识别元件特异性结合，产生物理/化学反应；传感器将接收到的物理/化学反应信号转化为可测量的电、光、声音、温度等信号，并对产生的信号进行放大、处理并输出（图1）。测量到的信号可以间接反映待测物质的浓度。

图1 生物传感器原理模式图[7]

2 生物传感器分类

生物传感器分类方式较多：根据使用的传感器器件检测原理分为电化学传感器、压电传感器、光学传感器、热传感器和声学传感器；根据待测物质与分子识别元件的结合方式分为亲和型、代谢型或催化型生物传感器；根据生物识别元件不同，可分为酶生物传感器、免疫生物传感器、微生物传感器、细胞生物传感器以及DNA 生物传感器[11-13]。其中，以不同生物识别元件分类的生物传感器应用较广，其原理及特点如表1 所示。此外，不同类型的生物传感器可以相互组合使用，这样能够有效提高生物传感器的检测灵敏度及特异性[14]。

表1 不同生物识别元件的生物传感器

2.1 酶生物传感器

酶生物传感器是基于酶与其底物之间起反应起作用的一类生物传感器[15]，分为底物检测和酶抑制两个主要机制。酶生物传感器应用较为广泛，可用于食品成分和添加剂分析，以及尿液中葡萄糖、尿素及动物产品中兽药残留的检测等[16]。Ang等[17]将葡萄糖氧化酶（GOD）-壳聚糖膜复合物修饰在铂工作电极上，构成了电化学酶生物传感器，用于水果中的葡萄糖含量检测。该生物传感器具有良好的稳定性，与商业化葡萄糖测定试剂盒对比发现两种方法无显著差异，但在2 个月后该生物传感器仅保留了36%的初始活性。Amor-Gutiérrez 等[18]将低成本的镀金连接器应用到生物传感器上。该生物传感器具有制作成本低的优势。Bidmanova 等[19]构建了一种用于检测卤化环境污染物的酶生物传感器。用1,2-二溴乙烷和3-氯-2-（氯化钾）-1 丙烯对该生物传感器进行验证，结果显示线性相关性良好，检出限分别为0.133和0.014 mmol/L。该生物传感器为卤化环境污染物的持续现场监测提供了一种快速有效的检测方法。

2.2 微生物传感器

微生物传感器是一种将微生物与传感器集成在一起，通过微生物和目标化合物之间的相互作用，将转导器产生的信号与分析物浓度相关联从而实现检测的一类生物传感器[20]。微生物中含有多种酶，作为识别元件，稳定性好，使用寿命长，但同时其选择性和灵敏度受到限制。近年来，大量的微生物传感器应用于环境、食品和生物医学等领域。Liang 等[21]开发了一种乙醛光学微生物传感器，能够对环境中乙醛进行检测，检测限可达0.33 μm，具有极好的底物特异性；与色谱法相比，该方法操作简单，稳定性好，性价比高。刘晓晓等[22]构建了基于微生物燃料电池的微生物传感器，可用于对水环境中重金属污染监测，对重金属离子的检测效果相对稳定高效，重复性良好。Khan 等[23]利用葡萄糖/半乳糖结合蛋白（GBP）的突变体构建了一种可以用于检测血糖浓度变化的荧光传感器，与传统方法相比，该生物传感器不仅不受体内电活性物质干扰，还能够持续监测患者体内血糖变化情况。

2.3 免疫生物传感器

免疫生物传感器是利用抗原和抗体之间的特异性识别功能研制的一种生物传感器。该传感器的关键在于要将抗体固定在检测器表面，并且抗体类型要根据选择特性及合成方式来确定[24]。Ren 等[25]利用分离的高亲和力载体蛋白E 特异性N-溴代丁二酰亚胺，建立了一种对阿尔兹海默症临床诊断和实时检测的免疫生物传感器。该传感器可以配合影像设备及分析软件使用，实现图像数据化分析，因其操作简单，在落后地区有潜在的应用价值。孔壮等[26]研发了一种电化学免疫生物传感器。该传感器能够实时了解体内激素含量，灵敏度高，成本低，最低检测限为1 mIU/mL，检测时间可控制在10 min。该传感器弥补了免疫生化检测仪器检测成本高、时间长的不足，可应用于现场快速检测。

2.4 DNA 生物传感器

DNA 生物传感器是由序列特异性探针和信号换能器组成的分析设备[27]。该传感器以固定在信号转换器界面的DNA 探针作为识别元件，探针识别目标DNA 后，经信号转换器将信息转换为可以分析测量的信号，从而实现对目的DNA 的检测[27-29]。Shakoori 等[30]开发了一种检测乙型肝炎病毒（HBV）的电化学生物传感器。该传感器在区分互补DNA、非互补DNA 序列和错配DNA 序列方面有良好的特异性和灵敏度，目的DNA 序列的最低检出限为2.0×10-12mol/L。在此基础上，Mohsen 等[31]将电化学技术、纳米技术与生物传感器结合，构建了能够在较低浓度下以无标记方法检测乙型肝炎的高灵敏DNA 生物传感器，检测限可达到1 fmol/L，大幅提高了传感器的灵敏度、选择性及可区分性。Ohk 等[32]设计了一种基于抗体和适配体的光纤DNA 生物传感器，将其用于食品中单核细胞增生李斯特菌检测。证明抗体和核酸适配体的结合具有高度的特异性，能够实现单核细胞增生李斯特菌的快速检测。

2.5 细胞生物传感器

细胞生物传感器是利用固定化活细胞作为生物识别元件，通过分析换能器产出的信号强度与被分析物之间关系来实现检测目的的一种装置[33-34]。细胞传感器根据细胞类型可以分为微生物细胞和动物细胞两大类。Tian 等[35]构建了一种基于精子细胞的生物传感器，该传感器采用小鼠活精子细胞作为主要敏感元件，细胞内钙离子荧光探针（Fluo4-AM）作为传感器，与流式细胞术结合，实现对苦味化合物的快速定量检测。该传感器特异性高，检出限低，且操作简单，价格低廉，弥补了传统检测方法成本高、个体变异大等缺点，能够为制药、食品工业和生物安全等多个领域的苦味物质综合评价提供一种新的、高效的方法。Sun 等[36]开发了一款基于微流控细胞的生物传感器。该传感器由毫秒化学脉冲发生器和表达内源性P2Y 受体的NIH-3T3 细胞作为传感元件，并采用脉冲方式引入样品，能够实现对液体环境中的ATP 检测，最大限度地减少受体的脱敏，延长传感器使用时间。

3 生物传感器在动物疫病检测方面的应用

3.1 病毒性疾病

3.1.1 禽流感 禽流感（AI）是由禽流感病毒（AIV）引发的一类疾病，其中高致病性禽流感引起的死亡率高，传播速度快，给养殖业带来巨大的经济损失[37]。AIV 可在宿主体内长期存在，具有高度的遗传变异性。Dong 等[38]建立了一种基于DNA 四面体纳米结构的电化学生物传感器。该传感器能够与H7N9 AIV 的目标ssDNA 杂交，实现H7N9 AIV 的快速检测，还可以特异性地从其他类型的病毒（如H1N1 和H3N2 流感病毒）以及寡核苷酸的单基错配中识别H7N9 AIV 的靶DNA片段，对H7N9 AIV 目标核苷酸序列的检测限可达100 fmol/L，具有较大的应用潜力。Wong 等[39]首次提出了使用相强表面等离子体共振（SPR）生物传感器。该传感器在探测表面等离子激发时，P 偏振光和S 偏振光之间会产生陡峭相位变化，使传输的光束从传感器的表面旋转并通过偏振片对传输，在检测器上识别相应强度变化，分辨率为6.3×10-6RIU，相较于干涉测量的相位SPR 传感器和普通强度SPR 传感器分辨率高出一个数量级，可应用于H5N1 AIV 抗体生物标志物检测，其检出限为193.3 ng/mL。Park 等[40]通过病毒融合机制，开发了细胞模拟纳米颗粒（CMPs），可以在发病早期利用高致病性AIV（HPAIV）和低致病性AIV（LPAIV）在血凝素（HA）蛋白裂解上的差异实现对HPAIV 和LPAIV 的鉴别诊断，相较于仅能检测AIV 的快速试剂盒，灵敏度更高。而且，Park等探测病毒融合活性的方法证明了AIV 具有感染宿主细胞的能力。

3.1.2 猪繁殖与呼吸障碍综合征 猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS），又称猪蓝耳病，由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）引起。怀孕母猪和仔猪对PRRSV 最易感，感染后表现为呼吸障碍和繁殖障碍[41]，皮肤发绀，双耳皮肤变蓝，肺部病变严重呈弥漫性间质性肺炎，是全球养猪业面临的严重威胁之一。Kuitio 等[42]开发了一种适配体生物传感器。与传统的PRRS 诊断方法相比，该方法更加快速准确，特异性和选择性较高，耗时短，可直接检测病毒颗粒，但检测限为1.87×1010个PRRSV 颗粒，灵敏度还有待改进。Liu 等[43]构建了一种氧化石墨烯（GO）改进的SPR生物传感器，用于检测培养细胞中的PRRSV，相较于传统的检测技术，该生物传感器可以实现病毒的无损实时动态检测，对于研究病毒与生物分子或抗病毒药物的相互作用具有重要意义。

3.1.3 非洲猪瘟 非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）所引起的猪和野猪的急性、发热、高死亡率的传染性疾病，其发病机制复杂，防控难度大[44]，给养猪业带来了极大经济损失。Li等[45]选择截断的p54 蛋白作为抗原，并与掺杂铕的荧光微球偶联，结合横向流动检测（LFA）技术，快速、可视化检测ASFV 抗体。该方法特异性较好，且检测结果与ELISA 试剂盒一致。为了提高检测的灵敏度，Li 等[46]构建了基于抗体双量子点微球（QDM）的ASFV 免疫传感器，可用于血清中ASFV 抗体的检测。与ELISA 和胶体金免疫层析试纸条方法相比，该生物传感器更加稳定和灵敏，其定量分析性能也得到一定程度的提高。

3.2 细菌性疾病

3.2.1 沙门氏菌病 沙门氏菌病是由沙门氏菌引起的一类常见的人兽共患病，不仅危害人类健康，还会给畜牧业带来巨大经济损失。畜禽感染沙门氏菌可引起相应的传染病，如鸡白痢、猪霍乱等[47-48]。而沙门氏菌血清型众多，传播方式复杂，传统检测方法难以实现沙门氏菌的有效检测。Sridapan 等[49]研制了一种基于双层环介导等温扩增结合侧向层析技术的生物传感器，用于生产中弯曲杆菌和沙门氏菌的快速检测，其灵敏度较高，但检测易受到气溶胶污染。Ying 等[50]开发了一种利用杂交链式反应（HCR）进行信号放大的核酸横向流生物传感器（LFNAB）。该传感器检测合成DNA 的检出限为1.76 pmol/L，沙门氏菌检出限为3×103cfu/mL，无需酶、标签或复杂的设备。

3.2.2 猪链球菌病 猪链球菌病是一类危害较大的人兽共患病，主要表现为脑膜炎、心内膜炎、败血关节炎等[51]，哺乳仔猪和断奶仔猪多发，一旦发病，会对养殖业带来较大经济损失。其中，猪链球菌2 型毒性较强，引起的发病率较高[52]。Wang等[53]提出了一种基于模拟双酶和L-半酰胺酸信号放大策略的猪链球菌2 型的检测方法。该方法利用L-半酰胺酸与空心双金属合金纳米粒子相互作用形成纳米复合材料，能够大大增强过二硫酸氢酯的电化学发光（ECL）信号。与传统生物酶相比，该传感器在灵敏度、重复性及选择性方面等具有显著优势，为ECL 生物传感器信号放大提供了一种新方法。Ju 等[54]利用柠檬酸钠还原金盐，与猪链球菌2 型多克隆抗体偶联制备胶体金，建立了一种用于检测猪链球菌2 型抗原的免疫层析试纸条方法，其敏感性可达106CFU/mL。该方法具有可视化、高特异性等优点，可用于猪链球菌2 型抗原的现场即时检测。

3.3 寄生虫病

3.3.1 血吸虫病 血吸虫病是一种广泛流行但被高度忽视的寄生虫病，一般通过接触受感染的水，使得血吸虫幼虫透过皮肤而引起感染。血吸虫病目前虽然在大多数地区得到了控制，但为了实现降低发病率和最终消灭血吸虫的目标，做好监测和早期诊断是重中之重[55]。He 等[56]建立了一种检测日本血吸虫循环抗原的金纳米棒光学传感器。该传感器不仅弥补了传统病原生物学和免疫学方法无法对血吸虫病进行早期诊断的不足，还可用于血吸虫病患者血清的分析。Santos 等[57]构建了一种基于巯基苯甲酸（AMB）自组装单分子膜的高灵敏度电化学基因传感器。该传感器将金纳米粒子（AuNPs）和磁铁矿纳米粒子（Fe3O4-NPs）固定在AMB 上，用电化学阻抗谱（EIS）和循环伏安法（CV）监测杂交过程，从而提高了检测方法的灵敏性和特异性。

3.3.2 弓形虫病 弓形虫病是由弓形虫引起的一种人兽共患病，发病率高，可造成牛、羊等怀孕家畜流产及猪死亡，给畜牧业带来巨大经济损失[58]。Sousa 等[59]利用金纳米颗粒的光学特性，建立了一种针对弓形虫GRA6 抗原的检测方法。该方法相比于ELISA 等经典方法，显示出更好的敏感性和特异性。张玉娟[60]以重组的tSAG1 作为诊断抗原，建立了基于tSAG1 的纳米棒生物传感器和金纳米簇模拟酶可视化生物传感器。该传感器简化了反应系统，增强了可视化功能，降低了分析成本，能够用于弓形虫病诊断。

4 小结及展望

生物传感器相较于传统方法，具有智能化、可视化、微型化和功能多样化等优势，与智能化系统的结合，可以实现数据的自动采集、处理及分析，减少主观判断造成的误差。当前，生物传感器在动物疫病检测方面的应用不断增加，不同生物识别元件与电化学技术联用、纳米材料的应用及酶复合物的构建，缩短了检测时间，大大提高了生物传感器的特异性、亲和力和抗干扰能力。但是现有的生物传感器仍然存在一些问题，例如，双层环介导等温扩增结合侧流生物传感器在操作过程中易出现假阳性，酶生物传感器检测效果随着酶活性降低而发生变化，DNA 生物传感器易出现碱基错配等。随着技术水平和工艺的不断提高，生物传感器与新兴学科领域或新型材料的结合，将进一步提高其检测效率、实用性和适用性，在动物疫病检测与防控领域会有更广阔的应用前景。