阴道内环境、阴道病原体感染性疾病与高危型HPV感染的相关性研究

李 磊，王月妹，吴 娟

1.上海市静安区市北医院检验科，上海 200435;2.上海市皮肤病医院性病科，上海 200443

宫颈癌是女性最常见的下生殖道恶性肿瘤，全球每年新诊断宫颈癌近53万例，其中超过13万例患者来自中国[1]。高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染是引起宫颈癌和癌前病变的最主要因素，几乎全部的宫颈癌病理组织及接近90%的宫颈上皮内瘤变中能检测出HR-HPV感染[2]。对于大多数女性来说，人乳头瘤病毒(HPV)感染是短暂的，HPV可以被宿主自行清除。然而，仍有5%～10%的HPV感染不能被清除，它们会成为导致宫颈癌和其他类型癌症的持续性感染[2]。阴道内环境为阴道内正常的定植菌群、宫颈阴道解剖结构、宿主免疫功能及体内外环境之间构成一个重要的微生态。在正常情况下，女性阴道内环境处于平衡状态，当非优势菌群或病原体繁殖时，优势菌群不再为乳酸杆菌，动态平衡被打破，容易被外来微生物侵袭[3]。目前越来越多的研究发现,阴道菌群失衡、pH值变化、清洁度改变等阴道内环境动态失衡后导致的一些生殖道感染性疾病在某种程度上与HPV感染、宫颈上皮内瘤变及宫颈癌有关联[4-5]。通过深入探讨阴道内环境、阴道感染与宫颈HPV感染之间相互作用，可为宫颈癌预防、治疗提供更多有力依据。国内外关于HPV感染与阴道内环境、阴道感染的相关性研究较少，尤其是缺乏大样本量的研究。因此，本研究选择上海市静安区市北医院2020年8-12月收治的妇科及皮肤性病科门诊女性患者，着重分析阴道病原体感染性疾病及阴道内环境与HR-HPV感染的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2020年8-12月在上海市静安区市北医院妇科及皮肤性病科门诊就诊的女性患者221例，年龄17～65岁，平均(43.0±13.8)岁，通过采集阴道分泌物检测阴道内环境(pH值、H2O2、白细胞酯酶、唾液酸苷酶)、阴道病原体及HPV分型。所有患者均满足以下标准：(1)月经规律，有性生活史；(2)怀疑HR-HPV感染和阴道内感染；(3)确诊前1周，无性行为史，未使用阴道塞及进行阴道冲洗等治疗；(4)非月经期；(5)近期未行HPV分型检测。排除标准:(1)因其他疾病行全子宫切除术；(2)怀孕；(3)有严重恶性肿瘤、艾滋病及其他免疫缺陷疾病。

1.2方法

1.2.1标本采集 (1)阴道病原体检测标本的取样：患者取膀胱截石位，将扩阴器润滑后放入阴道内暴露子宫颈，以干棉签从阴道上1/3侧壁取材，在清洁载玻片上均匀涂抹；另取1根棉签于相同部位刮取分泌物，置于试管内。(2)HPV检测标本的取样：用扩阴器暴露子宫颈，棉拭子将子宫颈口过多的分泌物擦去，使用专用的子宫颈刷置于子宫颈管内，顺时针旋转3～5周，然后抽出子宫颈刷，将其放入装有保存液的标本管中，由检验医师检测及报告结果。在采集标本前均取得患者的知情同意。主要试剂：阴道炎联合检测试剂盒、HR-HPV分型核酸检测试剂盒。

1.2.2阴道病原体及阴道内环境检测 (1)滴虫：生理盐水湿片于低倍镜下观察有无滴虫、孢子等。(2)细菌:取阴道分泌物涂片置于高倍显微镜下观察线索细胞数量，取少许阴道分泌物放到载玻片上，加入10%氢氧化钾1～2滴进行胺试验。(3)念珠菌：将取得的分泌物放到载玻片上，加10%氢氧化钾，盖上一片薄且平的玻璃片于显微镜下观察。(4)pH值、H2O2、唾液酸苷酶、白细胞酯酶：取阴道分泌物涂在联合检测试剂盒上进行检测。阳性判定标准：(1)阴道病原体感染性疾病，参照细菌性阴道病(BV)、滴虫性阴道炎(TV)、念珠菌性阴道炎(VVC)[6]诊断标准。(2)阴道内环境指标(pH值，以及H2O2、唾液酸苷酶、白细胞酯酶)阳性判定标准，根据阴道炎联合检测试剂盒(干化学酶法，江苏硕世生物科技股份有限公司)说明书判定结果。

1.2.3HPV分型检测 (1)检测步骤：参照试剂盒[HR-HPV分型核酸检测试剂盒(荧光PCR法)，上海之江生物科技股份有限公司]说明书提取子宫颈细胞DNA于ABI7500荧光PCR检测仪(Applied Biosystems，美国)进行PCR扩增，最后收集荧光信号，分析、判断HPV的型别。(2)阳性判定标准：对照试剂盒说明书，通过分析各孔中HPV核酸荧光PCR检测混合液对应荧光通道的Ct值及扩增曲线，判断该型HPV检测阳性，共14种HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)，结果为单一或者混合HR-HPV感染。

1.2.4分组 根据HPV-DNA分型结果分组，HR-HPV阳性者为研究组，HR-HPV阴性者为对照组。

1.3统计学处理 采用SPSS24.0软件进行数据处理和统计分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，采用二元Logistic回归分析HR-HPV感染的危险因素，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1HR-HPV检测结果 14种HR-HPV基因型检测结果显示，221例研究对象中HR-HPV感染173例(78.3%)，较常见的感染类型分别为HPV52(46例，20.8%)、HPV16(29例，13.1%)、HPV58(29例，13.1%)。相对其他型别的HR-HPV，HPV31、HPV35更易出现单一感染，而HPV45及HPV66更易与其他类型共同感染。见表1。

表1 HR-HPV各型别检测结果[n(%)]

2.2阴道内环境、阴道病原体感染性疾病与HR-HPV感染关系 根据HPV-DNA基因分型结果分组，研究组173例，对照组48例。两组年龄差异无统计学意义[(42.0±13.8)岁vs.(44.5±13.9)岁,P>0.05]。221例研究对象中诊断为BV、TV、VVC的患者例数分别为108、5、60例，占总人数的48.9%、2.3%、27.1%； pH值≥4.8，H2O2、白细胞酯酶、唾液酸苷酶检测阳性例数分别为130、99、123、42例，占总人数的58.8%、44.8%、55.7%、19.0%。研究组BV及VVC患者比例高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，而两组阴道内pH值≥4.8，H2O2、白细胞酯酶、唾液酸苷酶阳性，TV患者比例差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 阴道病原体感染性疾病患病情况及阴道内环境指标阳性率在两组间比较[n(%)]

2.3HR-HPV感染的危险因素分析 以是否存在HR-HPV感染为因变量，以合并BV、VVC为自变量，二元Logistic回归分析结果显示，VVC是HR-HPV感染的危险因素，当合并VVC时，HR-HPV感染风险为非感染者的5.122倍(95%CI：1.74～15.078，P<0.05)。而其他指标均不是HR-HPV感染的危险因素(P>0.05)。见表3。

表3 HR-HPV感染的多因素二元Logistic 回归分析

3 讨 论

HPV是一类无包膜的球形小DNA病毒，其感染的细胞有两种存在形式:自由状态和整合状态。目前已发现超过100种不同类型的HPV，其中40种可以感染生殖道[7]。根据HPV诱发子宫颈癌的能力，它们又被分为低风险和高风险类别，低风险HPV-DNA在宿主细胞中相对游离，而大多数高风险HPV-DNA则整合到宿主基因组中，易导致基因缺失和突变，干扰癌基因和抑癌基因的表达，引起宫颈上皮内瘤变和侵袭性癌的发生。HR-HPV筛查已成为宫颈癌前病变治疗和一级预防的重点[7-8]。本研究发现，173例HPV感染者中最常见的感染类型分别为HPV52、HPV16、HPV58，这也是目前我国最常见的HPV感染类型，且HPV58、HPV16、HPV52病毒载量及持续感染与宫颈上皮内瘤变Ⅱ、Ⅲ级密切相关[9-11]，尤其是HPV58的感染率在我国的宫颈上皮内瘤变Ⅱ、Ⅲ级或者宫颈癌患者中为90%[11]。

BV、TV和VVC是目前最常见的阴道感染性疾病，感染各种类型的病原体可促使厌氧菌增殖，而厌氧菌及其代谢物可降解宫颈黏液，刺激阴道上皮细胞，并影响阴道内环境的天然防御功能。天然防御机制一旦被打破，会增加女性其他生殖道感染的风险[12-13]。有研究表明，阴道感染者菌群失调会促进HPV持续感染[14]。本研究发现，相对于非HR-HPV感染者，HR-HPV感染者BV及VVC比例显著增高(P<0.05)，然而两组间TV患者比例差异无统计学意义(P>0.05)。大量研究证实BV与HPV感染密切相关[14-15]，BV是成年女性最常见的阴道感染疾病，厌氧菌过度生长和伴随阴道pH值升高(>4.8)，一方面使微生态环境改变及阴道防御能力下降，另一方面BV患者阴道分泌物中唾液酶增加，破坏保护性黏膜屏障，导致上皮细胞微损伤或改变，增加宫颈HPV的易感性[15]，从而促进HPV感染及持续存在状态。但本研究二元Logistic回归分析发现，以BV、VVC阴性为控制值，结果显示BV感染并不是HR-HPV感染的独立危险因素，BV和HPV之间的关系仍需大样本临床数据进一步探讨及证实。

念珠菌是另一种常见的机会性阴道致病微生物，仅在机体免疫力低下或者阴道酸性环境改变的情况下易患VVC[16-17]。LIANG等[18]的一项回顾性Meta分析发现，VVC与HPV感染无相关性，同时念珠菌感染有助于机体减少HPV感染的概率。 WANG等[19]对4 449例患者的分析也发现，VVC与HPV感染无相关性，推测可能的原因是念珠菌感染的女性可能具有以乳酸杆菌为主的阴道微生物菌群，阴道内环境未发生明显改变，因此，更不容易感染HPV[19]。但在笔者的研究中发现，173例HR-HPV感染者中VVC患者人数为56例，占32.4%，而48例非HR-HPV感染人群中仅有4例感染VVC，占8.3%，研究组VVC患者比例显著高于对照组，且OR为5.122，合并VVC是HR-HPV感染的危险因素。与以上研究结果不一致可能和样本类型及例数有关，VVC与HPV之间的关系仍需大样本临床数据进一步证实。TV和HPV感染之间的关系尚存争议，本研究发现TV与HR-HPV感染无关，这与LIANG等[18]的研究结果一致。

有研究表明，阴道内pH值与HPV持续性感染及宫颈上皮内瘤变发展至宫颈癌密切相关[18]。还有研究针对9 165例女性患者展开的一项临床研究发现，阴道pH值不仅与HPV感染有关，而且与年龄密切相关[20]，但本研究发现pH值与HR-HPV感染无关，可能由于本研究样本量小且研究受到横断面调查的限制，阴道感染和HR-HPV感染的数据为同时收集。阴道感染、阴道内环境失衡和HPV感染之间的关系，尚待进一步的纵向研究和分子研究。

综上所述，VVC与HR-HPV感染有关，而合并BV、TV，pH值、年龄与HR-HPV感染无关。