蜜蜂遗传育种新技术（四）——基因芯片主要技术流程与应用

薛运波│文

基因芯片又叫DNA 芯片、DNA 微阵列，是在DNA 杂交技术的基础上发展起来的、高通量的基因克隆与杂交信号间一对一的对应识别技术。它是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有序地、高密度地排列固定于介质载体上，以待测的核酸分子样品为探针，经过荧光、生物素等发光信号元素或基团的标记，与固定在载体上的DNA 阵列中的点按照碱基配对原理同时进行杂交。通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片加以扫描，检测杂交信号强度（图1），获取样品分子的数量和序列信息，再用计算机软件处理分析数据，从而对基因序列及功能进行大规模、高通量的研究。

图1 核酸杂交设备（薛运波 李兴安 摄）

1.基因芯片主要技术流程

基因芯片技术的主要流程包括芯片的设计与制备、靶基因的标记、芯片的杂交与信号检测。基因芯片的设计是指芯片上核酸探针序列的选择以及排布，设计方法取决于其应用目的。目前的应用范围主要包括基因表达和转录图谱分析及靶序列中单碱基多态位点（SNPs）或突变点的检测。

基因芯片的制备方法主要包括点样法和原位合成法两种类型：

（1）点样法：首先是探针库的制备，根据基因芯片的分析目标，从相关基因数据库中选取特异的序列，进行PCR 扩增或直接人工合成寡核苷酸序列，然后通过计算机控制的三坐标工作平台，用特殊的针头和微喷头，分别把不同的探针溶液逐点分配在玻璃、尼龙等载体表面的不同位点上，采用物理的和化学的方法使之固定。

（2）原位合成法：在玻璃等硬质载体表面上直接合成寡核苷酸探针阵列（图2）。主要有光去保护并行合成法、压电打印合成法等，其关键是高空间分辨率的模板定位技术和高合成产率的DNA 化学合成技术，适合制作大规模DNA 探针芯片，实现高密度芯片的标准化和规模化生产。

图2 核酸纯化设备（薛运波 李兴安 摄）

样品的制备是基因芯片实验流程的一个重要环节。靶基因在与芯片探针杂交之前必须进行分离、扩增与标记。标记的方法根据样品来源、芯片类型和研究目的的不同而有所差异。通常是在待测样品的PCR扩增、逆转录或体外转录过程中实现对靶基因的标记。

基因芯片与靶基因的杂交过程，与一般分子杂交的过程基本相同。杂交反应的条件，要根据探针的长度、G+C 含量及芯片类型确定。用于基因表达检测的芯片杂交严格性较低，而用于突变检测的芯片杂交条件相对严格。如果是用同位素标记靶基因，其后的信号检测即是放射自显影。若用荧光标记，则需要一套荧光扫描及分析系统作为设备支持。

2.基因芯片的应用

目前，基因芯片被广泛应用于基因表达图谱的绘制。近年来，随着基因芯片技术的发展和成熟，已经成功构建了一些昆虫抗性相关基因芯片，并投入对昆虫抗药性的研究（图3）。Shen 等构建了淡色库蚊的细胞色素P450 基因芯片，对24 个CYP4 家族基因在淡色库蚊抗性和敏感品系中的差异表达进行检测。Le Goff 等也构建了一个黑腹果蝇的细胞色素P450 基因芯片，对抗不同杀虫剂的果蝇的基因表达变化进行研究。Wu 等和David 等也都构建了不同的基因芯片，并对淡色库蚊和冈比亚按蚊的抗药性进行研究。这些基因芯片在昆虫抗药性研究中的应用，为了进一步揭示昆虫对杀虫剂的抗性机制，系统地理解不同的抗性相关基因之间的联系及其相互作用提供理论依据。美国伊利诺伊州大学Charlse 等人研究内勤蜂和外勤蜂：他们用含有大约5500 个基因的DNA芯片检测这两种蜜蜂的大脑组织提取物。结果发现，内勤蜂与外勤蜂之间的基因表达是不相同的，而不同的内勤蜂或不同的外勤蜂之间，其基因表达则非常相似。研究表明，基因和行为之间的联系程度比以前所认识到的更加密切。该研究结果将有助于发现开启特定行为的主要基因。

图3 核酸质谱设备（薛运波 李兴安 摄）

基因芯片技术的发展势头十分迅猛，在基因表达谱分析、基因诊断、药物筛选及序列分析等诸多领域已得到广泛地应用，取得大量的数据和研究结果，呈现出广阔的研究、开发与应用前景。但是该方法也存在不足之处，首先是基因芯片检测技术成本高，其次，该技术只能从基因突变和基因表达差异方面给予检测结果，尚不能根据分子检测结果对生物体的表型和功能做出整体评估。虽然基因芯片技术还存在一些不足，但是随着研究的不断深入和技术的不断完善，基因芯片一定会在蜜蜂科学研究领域发挥越来越重要的作用。