胚胎种植前遗传学检测助孕妊娠结局的影响因素研究

王博雅 ，何英明 ，薛吟霜 ，向卉芬 ，5*

植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）是以体外受精-胚胎移植（in vitro fertilizationembryo transfer，IVF-ET）为基础，在胚胎植入前从获得的囊胚中取出3～8个细胞，对其进行活检和遗传学诊断，筛选正常胚胎植入子宫，从而提高胎儿健康概率的一种孕前诊断技术。1990年HANDYSIDE等［1］报道了人类第1例PGT婴儿的出生。随后，在临床辅助生殖领域PGT扮演了重要的角色。随着PGT技术在人类辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）中的应用越来越多，全球范围内应用该技术治疗不孕不育的患者逐渐增多。胚胎异常（基因或染色体结构异常）是导致种植失败及流产比较公认的原因之一［2］。然而经PGT筛选后的正常胚胎仍有可能出现种植失败，其原因目前并没有形成统一的结论。因此本研究回顾性分析了行PGT治疗患者的一般资料及辅助检查结果、促排卵及体外胚胎发育情况，以探讨影响PGT患者种植失败及流产的危险因素，为降低PGT患者种植失败率及流产率提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 回顾性分析2018年12月至2021年2月在安徽医科大学第一附属医院生殖中心行PGT助孕的329例患者的临床资料。根据患者是否临床妊娠分为临床妊娠组（218例）和种植失败组（111例），临床妊娠率66.26%（218/329）。其中临床妊娠组再根据妊娠结局分为活产亚组（175例）和流产亚组（43例），流产率19.72%（43/218）。

诊断标准：（1）临床妊娠诊断标准，IVF-ET术后5周行阴道超声检查，若宫腔内可见孕囊则诊断为临床妊娠；（2）流产诊断标准，妊娠不足28周、胎儿体质量不足1 000 g而终止妊娠者诊断为流产。

本研究经安徽医科大学医学伦理委员会审核批准（审批号：20200838）。所有患者对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 研究方法 患者应用促排方案前禁食8 h以上，次日清晨于本中心测量身高、体质量，并计算体质指数（body mass index，BMI）。患者应用促排方案前分别于月经第2～3天及非月经期空腹抽取静脉血，测定各项生化指标，包括基础卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、基础黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）、空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）、 糖 类 抗 原 125（carbohydrate antigen 125，CA125）、25羟维生素D〔25-hydroxyvitamin D，25-（OH）D〕。

1.3 促排方案及PGT技术 患者均采用控制性促排卵方案，阴道超声提示卵泡有1个直径≥18 mm或2个直径≥17 mm或3个直径≥16 mm时注射10 000 U人绒毛膜促性腺激素（HCG，珠海丽珠），36 h后行超声引导下经阴道穿刺取卵术。取卵后4～6 h行卵胞质内单精子注射。受精卵体外培养5～6 d至囊胚阶段，抽取3～8个滋养层细胞活检，活检的囊胚进行玻璃化冷冻。应用微阵列比较基因组杂交技术或高通量测序分析染色体情况［3］。

1.4 胚胎移植 患者月经第2～5天予以补佳乐2 mg（德国拜耳），2次/d，口服。当阴道超声监测到内膜厚度≥8 mm 时，予以黄体酮60 mg，1次/d，肌肉注射转化内膜。5 d后胚胎解冻移植1枚PGT检测结果正常或平衡型的胚胎（指受精卵中2条不同源的染色体各发生断裂后，互相变位重接而形成两条结构上重排的染色体，这种易位大多数保留了原有基因总数，对基因作用和个体发育一般无严重影响）。

1.5 观察指标 分别比较临床妊娠组与种植失败组以及活产亚组与流产亚组的临床资料，包括年龄、BMI、不孕年限、不孕因素、既往流产次数（分为＜2次和≥2次）、内膜厚度、基础FSH、基础LH、LH/FSH、TSH、TC、TG、HDL-C、LDL-C、FINS、FPG、CA125、25-（OH）D等一般情况，及促排卵、胚胎发育情况，包括促性腺激素药物（gonadotropins，Gn）天数、Gn用量、第2次减数分裂中期（MII）卵率（MII卵数/取卵数）、受精率（受精数/MII卵数）、卵裂率（卵裂数/受精数）、D3优质胚胎数、胚胎活检正常率（活检胚胎正常个数/活检胚胎总数）。

1.6 统计学方法 采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析。非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验；计数资料以相对数表示，两组间比较采用χ2检验；将单因素分析中P＜0.1的变量纳入多因素Logistic回归分析探讨PGT患者发生种植失败及流产的影响因素；绘制受试者工作特征（ROC）曲线探讨多因素Logistic回归分析筛选出的危险因素对PGT患者发生种植失败及流产的预测价值，并计算灵敏度、特异度、约登指数。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床妊娠组和种植失败组患者临床资料比较 种植失败组年龄、BMI、既往流产次数≥2次占比、TG水平高于临床妊娠组，HDL-C水平、D3优质胚胎数低于临床妊娠组，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组患者不孕年限、不孕因素占比、内膜厚度、基础FSH、基 础 LH、LH/FSH、TSH、TC、LDL-C、FINS、FPG、CA125、25-（OH）D、Gn天数、Gn用量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。临床妊娠组MII卵率83.00%（3 311/3 989），受精率81.55%（2 700/3 311），卵裂率95.30%（2 573/2 700），胚胎活检正常率33.33%（472/1 416）；种植失败组MII卵率81.93%（1 600/1 953），受精率83.19%（1 331/1 600），卵裂率91.96%（1 224/1 331），胚胎活检正常率31.04%（219/625）；两组MII卵率、受精率、卵裂率、胚胎活检率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

效果分为显效、有效以及无效3个等级，显效是指患者治疗后的临床症状明显改善，透析过程中无低血压发生；有效是指患者的临床症状有所缓解，收缩压在透析的过程中基本正常；无效则为患者在治疗的过程中临床症状和体征无明显好转，并出现低血压[5]。

表1 临床妊娠组与种植失败组患者临床资料比较Table 1 Clinical data and examination findings in women with clinical pregnancy and implantation failure after preimplantation genetic testing assisted reproduction

2.2 活产亚组和流产亚组临床资料比较 流产亚组患者既往流产次数≥2次占比以及FINS水平高于活产亚组，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组年龄、BMI、不孕年限、不孕因素占比、内膜厚度、基础FSH、基础 LH、LH/FSH、TSH、TC、TG、HDL-C、LDL-C、FPG、CA125、25-（OH）D、Gn天 数、Gn用 量、D3优质胚胎数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。活产亚组MII卵率82.97%（2 679/3 229），受精率81.56%（2 185/ 2 679），卵裂率95.10%（2 078/2 185），胚胎活检正常率35.32%（403/1 141）；流产亚组MII卵率83.16%（632/760），受精率81.49%（515/632），卵裂率96.12%（495/515），胚胎活检正常率25.09%（69/275）；两组MII卵率、受精率、卵裂率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），活产亚组胚胎活检正常率高于流产亚组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 活产亚组与流产亚组患者临床资料比较Table 2 Clinical data in the live birth subgroup and abortion subgroup

2.3 PGT患者种植失败的影响因素分析 以临床妊娠结局（赋值：种植失败=0，临床妊娠=1）为因变量，以单因素分析中P＜0.1的变量（既往流产次数赋值：＜2次 =0，≥ 2次 =1；年龄、BMI、TG、HDL-L、Gn用量、D3优质胚胎数均为实测值）为自变量，纳入多因素Logistic回归分析，结果显示，低Gn用量是PGT患者种植失败的保护性因素（P＜0.05），既往流产次数≥2次和低HDL-C水平是PGT患者种植失败的危险因素（P＜0.05），见表3。

表3 PGT患者种植失败影响因素的多因素Logistic回归分析Table 3 Multivariate Logistic regression analysis of risk factors for implantation failure after preimplantation genetic testing assisted reproduction

2.4 PGT患者流产的影响因素分析 以活产结局（赋值：流产=0，活产=1）为因变量，以单因素分析中P＜0.1的变量（既往流产次数赋值：＜2次=0，≥2次=1；FINS、胚胎活检正常率均为实测值）为自变量纳入多因素Logistic回归分析，结果显示，低FINS水平是PGT患者流产的保护因素（P＜0.05），既往流产次数≥2次和低胚胎活检正常率是PGT患者流产的危险因素（P＜0.05），见表4。

表4 PGT患者流产影响因素的多因素Logistic回归分析Table 4 Independent risk factors for live birth outcomes identified by multivariate logistic regression analysis

2.5 既往流产次数≥2次，HDL-C水平、Gn用量对PGT患者发生种植失败的预测价值 绘制既往流产次数≥2次，HDL-C水平以及Gn用量预测PGT患者发生种植失败的ROC曲线，结果显示，既往流产次数≥2次、HDL-C水平以及Gn用量预测PGT患者发生种植失败的曲线下面积（AUC）分别为0.650、0.579、0.561，灵敏度分别为70.3%、33.3%、60.4%，特异度分别为59.6%、80.3%、56.9%，约登指数分别为0.299、0.136、0.173，见图1。

图1 既往流产次数≥2次、HLD、Gn用量预测PGT患者发生种植失败的ROC曲线Figure 1 ROC curves of two or more previous abortions，serum HDL-C level，and dosage of Gn for predicting implantation failure after preimplantation genetic testing assisted reproduction

2.6 既往流产次数≥2次、FINS水平以及胚胎活检正常率对PGT患者发生流产的预测价值 绘制既往流产次数≥2次、FINS水平以及胚胎活检正常率预测PGT患者发生流产的ROC曲线，结果显示，既往流产次数≥2次、FINS水平以及胚胎活检正常率预测PGT患者发生流产的AUC分别为0.648、0.629、0.641，灵敏度分别为66.2%、72.1%、65.1%，特异度分别为63.4%、52.6%、60.6%，约登指数分别为0.296、0.247、0.257，见图2。

图2 既往流产次数≥2次、FINS、活检正常率预测PGT患者发生流产的ROC曲线Figure 2 ROC curves of two or more previous abortions，fasting insulin level，and normal rate of embryo biopsy for predicting abortion after preimplantation genetic testing assisted reproduction

3 讨论

PGT是一种与体外受精相结合的方法，可在胚胎移植至母体之前检测胚胎中基因情况。因此，PGT技术可以确保被移植的胚胎没有可检测到的遗传畸变。随着该技术近年来的发展，将PGT分为PGT-M、PGT-A、PGT-SR 3种，PGT-M可以用来检测胚胎植入前单基因遗传病，可以识别胚胎中家族携带的致病突变，并移植没有这种致病突变的胚胎，有效降低后代出现相关遗传疾病的发生率；PGT-A可以检测胚胎植入前染色体非整倍体，可以筛选出胚胎中染色体正常的胚胎，移植至母体可以有效降低流产、异常妊娠和植入失败的风险；PGT-SR检测胚胎植入前染色体结构异常，主要应用于染色体疾病的检测，包括染色体整倍体或非整倍体的数目异常，如克氏综合征（47，XXY）、21-三体综合征（47，XN，+21）等，以及缺失、重复、易位、倒位的染色体结构异常。PGT技术具有极高的准确性和稳定性［4］。本研究分析了PGT患者的一般情况促排卵及体外胚胎发育情况后发现，低Gn用量是PGT患者种植失败的保护性因素，既往流产次数≥2次、HDL-C低是PGT患者种植失败的危险因素。低FINS是PGT患者流产的保护性因素，既往流产次数≥2次、低活检正常率是PGT患者流产的危险因素。

有不良妊娠史的患者应用PGT技术的治疗效果尚未形成统一定论。有研究表明，应用PGT技术可以改善既往流产次数≥2次患者的妊娠结局，降低流产率及出生缺陷的风险［5］。而最新的一项临床随机对照试验表明，PGT并不能提高由于胚胎异常及反复植入失败导致的反复妊娠丢失（既往流产次数≥2次）患者的胚胎活产率［6］。本研究结果显示，临床妊娠组与种植失败组以及活产组与流产组在既往流产次数≥2次的占比中存在差异，既往流产次数≥2次是PGT患者发生种植失败及流产的危险因素，既往流产次数≥2次预测PGT患者发生种植失败及流产的AUC分别为0.650、0.648，灵敏度分别为70.3%、66.2%，特异度分别为59.6%、63.4%，约登指数为0.299、0.296。PGT可以筛选优质胚胎移植入子宫，但不良妊娠史导致子宫内膜基底层损伤、蜕膜发育不良、胚胎着床异常、胎盘灌注不足等，最终依然可能导致再次妊娠失败或流产［7-8］。

本研究结果显示，种植失败组Gn用量高于临床妊娠组，低Gn用量是PGT患者发生种植失败的保护性因素，Gn用量预测PGT患者发生种植失败的AUC为0.561，灵敏度为60.4%，特异度为56.9%，约登指数为0.173。有研究表明，应用大剂量Gn会对卵泡颗粒细胞、卵母细胞造成损害，导致流产率升高，临床妊娠率和活产率下降［9］；但也有研究标明，高龄患者对Gn的敏感性有所下降，获得卵子更加困难，需要相应的增加促排卵期Gn用量［10］，同时增加Gn用量可以获得更高比例形态、质量较好的胚胎［11］。本研究结果显示种植失败组年龄高于临床妊娠组，且种植失败组Gn用量高于临床妊娠组，高龄患者应用Gn剂量高、流产率高，可能是患者年龄较高所致，并不能说明患者应用高剂量Gn是导致种植失败的原因。虽然基础研究证实，高剂量Gn会损伤卵母细胞［9］，但临床上为获得数量更多的卵子而采取应用高剂量Gn，适当应用高剂量Gn对于患者“利大于弊”。因此，应用高剂量外源性Gn对于辅助生殖结局的影响目前仍有讨论空间，需要更多的临床资料及基础研究进一步探索。

临床工作中，通过检测TC、TG、LDL-C、HDL-C的水平来反应患者血脂代谢情况，以上任何一种指标出现异常均称为血脂异常［12］。有研究指出，在细胞线粒体内，脂质水解产生ATP为卵母细胞和胚胎发育提供能量［13］。血脂异常会直接或者间接损害卵母细胞和胚胎，最终导致不良的妊娠结局［14］。本研究结果显示，临床妊娠组与种植失败组的HDL-C存在明显差异，低HDL-C水平是PGT患者发生种植失败的危险因素。HDL-C预测PGT患者发生种植失败的AUC为0.579，灵敏度为33.3%，特异度为80.3%，约登指数为0.136。相较于临床妊娠组，种植失败组患者的HDL-C更低。研究发现，卵泡液中HDL-C及其组成成分载脂蛋白A1对人类早期胚胎发育起保护作用［15］。HDL-C是复杂的多功能蛋白复合体，针对其研究多数在心血管方向，而HDL-C在生殖领域的研究相对匮乏。本研究为HDL-C在生殖领域的研究提供了参考依据。

本研究结果显示，活产亚组与流产亚组的FINS水平存在统计学差异，低FINS水平是PGT患者发生流产的保护性因素，FINS预测PGT患者发生种植失败的AUC为0.629，灵敏度为72.1%，特异度为52.6%，约登指数为0.247。相较于活产组，流产组FINS水平更高。研究表明，高胰岛素血症和胰岛素抵抗的女性生育能力降低［16］。多项研究发现，高胰岛素血症患者的胚胎植入能力降低，胚胎植入后流产率高［17-19］，本文结果与之一致。在分子层面，胰岛素水平较高，胚胎着床部位和子宫内膜蜕膜标志物内膜泌乳素和骨形态发生蛋白2、子宫内膜容受性、孕激素受体的数量明显减少。胰岛素水平升高损害了小鼠子宫内膜蜕膜化，破坏了在子宫内膜蜕膜化过程中细胞增殖和凋亡之间的平衡［20］。因此，应严密监测PGD患者孕前FINS情况，必要时及时干预，以增加活产的成功率。

在IVF-ET过程中，胚胎染色体异常目前仍是导致胚胎质量下降的关键因素，受精时，胚胎质量降低可导致卵母细胞在减数分裂过程中发生错误，导致胚胎种植失败、胚胎停滞发育最终导致流产［21］。本研究结果显示，相较于活产亚组，流产亚组胚胎活检正常率更低；胚胎活检正常率是PGT患者发生流产的危险因素；胚胎活检正常率预测PGT患者发生流产的AUC为0.641，灵敏度为65.1%，特异度为60.6%，约登指数为0.257。研究表明，女性高龄［22］以及双方染色体异常［23］等多种因素会降低胚胎活检正常率，但并未具体阐明胚胎活检正常率对临床评估妊娠结局的应用价值。本研究纳入了行PGT检测的IVF-ET患者，分析发现胚胎活检正常率与活产结局的相关性与预测活产结局的临床价值，为临床诊治患者提供参考依据。

综上所述，既往流产次数≥2次、HDL-C的水平、Gn用量是PGT患者种植失败的影响因素且对PGT患者种植失败的发生有一定的预测价值；既往流产次数≥2次、FINS的水平、胚胎活检正常率是PGT患者流产的影响因素且对PGT患者流产的发生有一定预测价值。于种植胚胎前监测上述指标，对PGT患者制定合理个性化的用药方案，提高临床妊娠率及活产率，有一定参考意义。本研究的样本数据非多中心系统性调查，故存在病例选择的偏倚及信息偏倚，本课题组正积极与全国各中心交流合作，后续将进一步扩大样本并验证本研究结果。

作者贡献：王博雅负责文章的构思、研究的设计、撰写论文；王博雅、何英明、薛吟霜负责文献、患者资料的收集、数据收集与整理；王博雅、何英明进行结果的分析与解释；向卉芬对文章整体负责，负责论文的可行性分析、修订、文章的审查及监督。

本文无利益冲突。