植物源天然产物中绿原酸提取方法的研究进展

贾 娟，宋安琪，王婷婷，李艳秋

（1.河南工业大学 漯河工学院，河南 漯河 462002；2.漯河职业技术学院，河南 漯河 462002；3.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

0 引言

天然产物是指从存在于自然界中的生物体内经分离、提取得到的有机化合物，包括植物、动物和微生物体内的组成成分或其代谢产物，以及人和动物体内许多内源性的化学成分[1-2]。按照来源可分为3 类：植物源、动物源、微生物源，其中大部分来源于植物，药用植物更是天然产物最重要的来源[3]。在种植方面，由于我国国土辽阔，经纬度跨幅大，土地类型多样，大部分处于温带和亚热带，气候适宜，所以除生长条件特殊的植物外基本都可在国内种植栽培。

来源于植物界天然产物中的有效成分主要有绿原酸、黄酮类、环烯醚萜类、木脂素类、生物碱类、皂苷类等。其中，绿原酸是由咖啡酸和奎尼酸合成具有不饱和双键的脂类化合物[4]。目前，绿原酸的主要商业来源是植物类材料的提取物，如杜仲科植物，忍冬科植物及菊科植物，在杜仲叶、蒲公英、山银花、金银花、烟叶中含量较高[5]。绿原酸具有抗菌抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、降血糖血脂、抗紫外光与辐射等生理功能[6]，广泛应用于食品、药品和保健品中。黄酮类化合物，又名生物类黄酮，是大量存在于自然界植物中的一类天然活性成分，属多酚类化合物中的一个亚类[7]，具有抗氧化、保护心血管、增强免疫力、护肝保肝等药理作用[8]。环烯醚萜类化合物为单萜化合物，广泛存在于自然界中，具有抗氧化，抗癌，防衰老、保护心脏、降血糖等药理作用[9]。木脂素类化合物是一种复杂的天然酚类聚合物，是自然界有机资源中除纤维素外含量最丰富的芳香族化合物，具有抗氧化、抗菌、降低血清胆固醇等药理作用[10]。生物碱类化合物是一种主要存在于植物中的一类含氮化合物，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等生物活性[11]。皂苷是一种结构较复杂由皂苷元与糖构成的化合物，主要存在于陆地高等植物中，具有延缓衰老、抗肿瘤、改善记忆力与学习能力、增强免疫力等药理作用[12]。

1 植物源天然产物中绿原酸的提取

绿原酸的提取方法较多，包括一些传统方法和新兴方法，如水提法、回流提取法、超声提取法、微波辅助提取法、酶法、酶解-超声组合法、超临界萃取法等[13]。

1.1 水提法

水提法又称煎煮法，是一种将样品加水浸没，加热煮沸一定时间后，分离浸出液，多次循环加热水煮样品，最后合并浸出液的方法。这是一种非常传统古老且延续至今的方法。使用该法进行提取，得出的浸出液成分复杂，比较黏稠，过滤困难，不利于精制。并且要求提取的目标物能溶于水，对温度、湿度均稳定适应。虽然相较于后续接连出现的新提取方法，如微波辅助提取法、回流提取法、超声提取法等，该法的提取率确实不高，但此法却可以避免产生有机溶剂的污染，保护生态环境。李玉山等人[14]分别采用水提法和醇提法对杜仲叶中的绿原酸进行提取，2 种方法经试验优化后确定最佳试验条件，水提法最优工艺为提取温度60 ℃，料液比1∶10，提取时间1.5 h，提取次数2 次，提取率达4.22%；醇提法最优工艺为料液比1∶15，乙醇体积分数30%。提取时间2 h，提取次数2 次，提取率达4.41%。结果显示，虽然醇提法的提取率确实优于水提法，但优势不大，且醇提法所费时间更长，用料更多。从李玉山等人的试验数据来看，水提法更优。刘欣等人[15]也分别采用了水提法和醇提法对山银花中的绿原酸进行提取，经优化得出最佳工艺条件后，水提法的提取率可以达到4.51%高于醇提法的3.14%。

综合以上2 篇论文研究结论来看，在提取绿原酸上，水提法优于醇提法，可能是因为绿原酸是一种水溶性较好的有机物，再者水提法几乎不需要消耗药品，简单环保，所以在实验室条件只能二选一时，推荐使用水提法。

1.2 回流提取法

回流提取法是指采用加热回流装置，用易挥发的有机溶剂（如乙醇）提取样品成分，溶剂加热馏出后经冷凝管冷凝，又流回容器中浸提原料，如此往复，直至提取完全的方法。回流法属于较传统的提取方法。该方法的缺点是提取出来的绿原酸损失过大，质量不纯，而且耗费的时间长，不适用于提取受热易分解的物质，但操作简单，提取效率高于冷浸法。杨小峰[16]采用回流法提取苹果中的绿原酸，进行试验优化后，最终到的最优工艺为提取时间112.2 min，料液比1∶11，乙醇体积分数67%，此条件下得到的绿原酸最大提取量，可达2.780 mg/g。杨宪文等人[17]采用回流法提取忍冬藤茎叶中的绿原酸，最优工艺为回流温度80 ℃，料液比1∶12，乙醇体积分数80%，提取率可达1.752%。李泽昱等人[18]采用水提法和回流提取法提取金银花中的绿原酸，水提法提取绿原酸的得率达到2.6%，而回流法提取绿原酸的得率可达7.2%。

文献中可看出在提取绿原酸时，回流法所用的时间和水提法差不多，温度比水提法稍高，应该是试验方法本身差异导致的。单从提取率来说，回流法远优于水提法，如果不考虑溶剂消耗和提取质量，回流法是较好的选择。

1.3 超声波提取法

超声波提取法是利用超声波的空化、机械和热效应破坏细胞结构，使细胞内物质加速释出和溶解，有效提高提取效率的方法。一般情况下，超声波提取法比回流法提取的时间短，溶剂损失较少，提取效率较高。尹青等人[19]通过超声波法提取蒲公英中绿原酸的试验证实了超声波提取法优于乙醇回流法，前者所费时间更短，提取效率更高，对有效成分的破坏更低。并且经过试验优化确定了最佳工艺为乙醇体积分数60%，料液比1∶14，pH 值为2，提取温度50 ℃，提取时间50 min，提取率可达60%以上。吴红艳等人[20]使用甲醇溶液作为绿原酸提取剂提取杜仲叶中的绿原酸，经试验后得出各因素对提取率的影响效应为甲醇体积分数＞提取时间＞超声波功率，在甲醇体积分数70%，提取时间75 min，提取温度40 ℃，超声功率270 W 的最优提取条件下，绿原酸的提取率可达2.529%。采用超声波法提取山楂叶中的酚类化合物，包括绿原酸、侧柏苷、芦丁、金丝桃苷等，经过设计及优化得出的收率，与传统浸出法和热回流提取法相比，超声波法提取效率较高[21]。

以上比较试验用科学的数据证实了超声波法与传统方法不需要过高的提取温度和过长的提取时间，就可以实现高的提取率和提取纯度。

1.4 微波辅助提取法

微波辅助提取法是利用电磁波将成分与基体分离，且有效保持提取物的原本状态的一种方法。此方法提取时间短操作简单、快速有效。童玲等人[22]经正交试验得出乙醇体积分数60%，料液比1∶50，辐射时间2 min，微波压力2 atm 为最优微波提取条件，杜仲叶中的绿原酸提取率可达26.4%。黄荣等人[23]以聚二乙醇（PEG-200）为提取液，采用微波辅助法提取金银花叶中的绿原酸，经响应面优化试验得出最佳工艺条件为聚二乙醇体积分数40%，料液比1∶20，微波时间70 s，微波功率350 W，提取温度82 ℃，提取时间24 min，提取率达5.87%。刘志平等人[24]同样采用微波法提取金银花中的绿原酸，提取液改成乙醇溶液，经试验优化后得出最佳提取工艺为乙醇体积分数40%，料液比1∶15，提取2×60 s 次，提取率得7.065%。

从黄荣和刘志平的2 组试验数据上来看，不考虑原料、仪器、试验操作等因素，采用微波法提取金银花中的绿原酸时，提取液应选用乙醇溶液。与前3 种方法相比，微波提取不仅时间很短，而且提取效率高。

1.5 酶提取法

酶法是指利用生物催化剂酶对植物细胞壁的组成成分进行分解，以此提高有效成分提取率的一种方法。此法操作简单、条件温和、环保无害，然而需要注意在调节酸碱度时可能造成的某些酚类化合物被破坏。因为酶作用具有专一性，所以任小宁等人[25]在使用此法对杜仲叶中的绿原酸进行提取时，首先进行了酶选择试验，在半纤维素酶、纤维素酶、果胶酶3 种酶中以提取物得率为指标，选择纤维素酶进行后续试验。在最佳工艺条件为提取温度40 ℃，提取pH 值4.5，提取时间90 min，加酶量0.4%时，绿原酸得率为52.24 mg/g。

相较其他方法而言，因为酶的作用条件温和，所以提取温度不高，并且需要根据提取物种类提前选取酶，提高绿原酸的纯度。

1.6 酶解-超声组合法

酶解-超声组合法是一种较新的方法，主要是将两者结合起来，优势互补，较单一方法而言提取效率更高，提取质量更优。采用基于聚乙二醇（PEG-200）的酶辅助超声提取（EAUE）方法，对金银花叶中的绿原酸（CGA）进行提取并对提取工艺进行了优化、验证，且与其他常规提取工艺进行比较。在最佳提取工艺条件下，结果表明，聚乙二醇浓度为42%，萃取温度为49 ℃，pH 值为4.2 时，试验提取率为6.955%，与热回流提取相比，基于PEG 的EAUE 对金银花中CGA 的提取效率较高[26]。张凌裳等人[27]采用酶解-超声组合法提取杜仲叶中的绿原酸，并在最优条件下得出提取率为3.05%。

该方法与单纯的使用酶解法的得率为2.89%[28]和单纯使用超声波法的得率为2.61%[29]相比，可以看出两者结合之后绿原酸的提取率可以得到提升，分别是酶解法的106%，超声波法的117%。数据可以解释为什么酶法通常和其他方法联用。

1.7 超临界萃取法

超临界萃取法通过调节萃取剂流体的温度和压力，把不同溶解度的样品组分先后萃取出来以达到提取分离作用的一种方法。此法提取的绿原酸损失少、质量优，提取效率高，但因设备昂贵难以进行批量生产。有文献采用改良后的超临界CO2萃取金银花花芽中的绿原酸，并用高效液相色谱法（HPLC）对绿原酸进行分析。采用响应面法对工艺参数进行优化，优化后的提取条件为乙醇体积分数32%，萃取温度74 ℃，压力289 bar，得到的最大得率为5.51%[30]。Andrade K S 等人[31]在提取咖啡皮中的活性物质绿原酸和咖啡因时，也采用了超临界CO2萃取法，取得了不错的效果，结果表明在选择提取绿原酸的方法时，此法也应纳入考虑范围。但是，此法目前尚停留在实验室阶段，若工业化大规模提取还应选择其他方法。

以上是7 种比较常见的提取绿原酸的方法，这些方法各有利弊。在试验之前，首先应该考虑提取目的、提取场合、操作人员和操作条件。通过上文可以很清楚的得出以下结论，水提法和回流法作为最传统提取方法，提取率和提取质量低于其他方法；超声波法和微波法与酶法结合之后，可以显著提高提取率和提取物纯度；超临界萃取法没有其他方法适用范围广，但如果实验室有条件，在提取绿原酸时可优先考虑此法。

2 绿原酸的测定方法

通常测定绿原酸的方法有紫外分光光度法和高效液相色谱法。两种方法各有利弊，紫外分光光度法不够准确但仪器便宜，操作简单，所以使用广泛，而高效液相色谱仪虽然结果准确但是价格昂贵。近年来，近红外光谱法发展迅速，已然成为一种颇具前景的光谱分析方法。

3 绿原酸的应用

绿原酸可通过清除自由基或减弱其活性，达到抗氧化的目的，因此可以作为一种酚类天然抗氧化剂添加于食品当中[32-34]。研究还发现，绿原酸对油炸后的草鱼有护色作用，还可抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等多种腐败菌的生长，如肉制品在保存时，可考虑选用绿原酸这一天然抗菌防腐剂[35-36]。

由于绿原酸具有的抗菌抗病毒功效，金羚感冒片中主要的活性成分就是绿原酸；目前疫情大流行期间，针对新冠病毒具有明显治疗效果的连花清瘟胶囊的主要有效成分之一也是绿原酸[37]。不少美容产品中添加了绿原酸，以帮助皮肤抵挡阳光和屏幕辐射，保持皮肤弹性，抵抗衰老。

4 展望

随着各种流感、各种新型病毒、各种癌症肿瘤越来越严重且频繁地侵袭人类，人们对于身体健康状况也越来越重视。植物源天然产物被给予了更多关注，吸引了国内外众多学者专家的目光，对天然产物中各种活性成分的研究也更加深入。基于绿原酸多种益于人体的活性作用，研究绿原酸的提取工艺富有极大的学术价值和现实意义。

天然产物中绿原酸的提取方法有很多，大部分在与酶法结合后，其提取率、提取纯度都得到显著提高，提取时间、提取成本大大降低。其中，酶法与超临界萃取法相结合提取天然活性成分的报道较少，在绿原酸的提取中未见运用，但在花色苷的萃取中可见。花色苷属于黄酮多酚类化合物，与绿原酸类性质相近，因此可进一步推论，酶法-超临界萃取法可应用于绿原酸的提取，从而为植物源绿原酸的提取提供了一个新的理论依据。

综上所述，绿原酸具有多种益于身体健康的活性作用，可促使专家学者不断开创、完善绿原酸的提取工艺，使得绿原酸资源可以更多地被利用。然而，从现有的研究来看，虽然新兴提取技术酶解-超声组合法、超临界萃取等的提取率确有提高，但总体来说，普遍面临着提取效率、提取纯度较低或提取成本较高的问题。鉴于天然绿原酸的同分异构体较多，所以在提取时不能单纯注重提取率，还需要考虑单体提取的纯度问题。由于目前关于提取方法研究较少，因此在将来的发展中，可以针对性开发单体绿原酸的提取方法。