FV3000 激光扫描共聚焦显微镜的管理

王亚琴

（浙江大学农业与生物技术学院 水稻生物学国家重点实验室，浙江杭州 310058）

0 引言

FV3000 是一款高速、高灵敏度、高精确性，可实现从宏观到微观全面观察成像的全新一代活细胞成像工具，是目前市场上应用较为普遍的一款激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM），也是浙江大学水稻生物学国家重点实验室（以下简称水稻重点实验室）新引进的一台大型设备。由于它具有超分辨率成像和层析成像能力，相比一般显微镜，激光扫描共聚焦显微镜具有不可比拟的优越性，已经成为现代科学技术研究领域中的大型综合仪器。

随着高校开展前沿学科、交叉学科、学科群的建设，对仪器设备的使用及管理提出了更多的需求。大型设备的投入及运行对培养学生的创新能力，提高科研水平起着重要作用，同时也是衡量学院学科建设和科研水平的重要指标[1]。LSCM 作为大型仪器的一员，其本身价格昂贵、操作复杂、耗材消耗较大，使用及维护成本较高。为贯彻落实《国务院关于国家重大科研基础设施和大型科研仪器向社会开放的意见》（国发〔2014〕70 号）精神，优化资源配置，释放服务潜能，提高使用效率[2]，水稻重点实验室依托浙江省科技创新云服务平台，国有资产管理云服务平台，将FV3000 主动对接国家平台，并配置专业技术人员操作管理，实行开放共享。本文结合多年使用和管理经验，对FV3000激光扫描共聚焦显微镜的使用及规范管理进行总结，以期为相关的管理人员和使用者提供借鉴参考。

1 激光扫描共聚焦显微镜简介

共聚焦显微术（Confocal Microscopy）概念是20 世纪50 年代中期，由哈佛大学的Marvin Minsky 博士提出，并于1957 年申请技术专利，随后多名学者对共焦成像开展了更为细致的研究，但受限于激光及计算机等技术发展水平的制约，直到20 世纪70 年代才研制出第一台真正实用的共聚焦显微镜，80 年代中期才出现第一台激光扫描共聚焦显微镜。

LSCM 是一种典型的高技术光电仪器，它主要是把荧光显微镜、激光扫描及计算机图像处理等装置组合在一起，通过有效阻止非焦平面信息的干扰，提高扫描图像的分辨率和对比度，最终获得比较清晰的图像。同时，通过连续切片操作，三维图像的扫描和重构，获得样品的整体信息。另外，LSCM 可以定量分析细胞内的特定物质和信号，同时定位不同的成分[3]。作为一种技术含量较高的研究工具，LSCM 可以对样品进行定性、定量、定位和定时研究，由于这些强大的技术功能，目前，LSCM 在分子生物学、免疫学、遗传学、药理学、病理学、食品科学、材料科学等研究领域得到广泛应用[4]。

2 FV3000 的主要用途

FV3000 具有完成活细胞和组织成像所需的高灵敏度和高速度，可以为细胞、组织和较小的生物体完成2D 到6D（x，y，z，t，λ，p）的从宏观到微观的成像操作，同时具备直观且可以调整的用户界面，支持从图像采集到图像处理和分析的整个工作流程，其主要用途有：

（1）用于组织切片、生物材料荧光标记、活细胞荧光标记的高分辨率成像，同时得到清晰锐利的多层Z 平面结构的光学切片，用于构建标本三维实体结构，并做形态分析和三维空间测量。

（2）用于活细胞生物分子、细胞器或离子等生物物质的定性、定量、定时和定位分布检测等，适合用于快速变化样品，捕捉变化过程信号，可监测细胞内钠、镁、钙离子浓度变化，捕捉钙火花，并且缩短实验时间，降低光毒性。

（3）用于获取图像的时间信息，研究荧光标本随时间浓度、强度、扩散速度、空间移动等变化的数据信息，进行相关动力学研究。

（4）可对样本进行光谱扫描，获取荧光标本光谱信息，研究荧光材料光谱特性、获取未知染料发射光谱图。

3 FV3000 的组成和技术参数

3.1 激光照射系统

激光照射系统包括紫色固体激光器：405 nm；青色固体激光器：445 nm；蓝色固体激光器：488 nm；蓝绿色固体激光器：514 nm；绿色固体激光器：561 nm；红色固体激光器：640 nm。开放式和一体化的激光耦合器，通过单独一根高透过率光纤导出，近紫外到红光区域一体化色差校正，无须调节光纤中心。

3.2 共聚焦扫描检测系统

共聚焦扫描检测系统包括4 个独立的光谱型荧光检测通道和荧光检测器；1 个透射DIC 检测通道，所有通道可以独立设置不同激光；2 个大靶面制冷型超高灵敏检测器。

3.3 全自动倒置显微镜系统

全自动倒置显微镜系统包括8 孔电动激发块转盘，包含窄带带通紫外激发（UV）、窄带带通蓝光激发（B）和宽带绿光激发（G）3种；8 孔电动万能聚光镜，可适用物镜1.25～100 倍；130 W 超高压汞灯，无限远校正光学系统，齐焦距离为国际标准45 mm。

3.4 计算机工作站

计算机工作站配置有CPU Intel Xeon W-2133 3.6 GHz六核CPU，Windows 10 Professional 64 bit 操作系统。

3.5 图像采集及分析软件

图像采集及分析软件包含图像采集和系统自动控制，光路全电动控制切换，三维/四维可视图象重建功能，具有Alphablend、Isosurface、MIP 等多种三维渲染模式。

4 FV3000 显微镜室的环境要求

4.1 实验室内的温湿度尽量保持恒定

实验室内的环境温度应保持在20～24 ℃，湿度40%～60%，室内遮光。需要特别注意的是，在比较潮湿的地区要配备除湿器。

4.2 实验室要配备防震设备

激光扫描共聚焦显微镜应尽量放置在一楼，同时将设备安装在具有防振功能的专用台子上，防止因较高楼层的振动影响仪器的使用。

4.3 实验室内要保持干净整洁

定期对实验室进行清理，保持室内干净整洁，实验者进入实验室时要穿白大褂及鞋套，使用完毕后，要及时做好台面、物镜、目镜等容易被污染的光学部件的清洁工作。

5 FV3000 管理人员的要求及职责

5.1 管理人员要求

由于激光扫描共聚焦显微镜功能多样、硬件和软件配置都比较复杂，操作步骤又因样品和成像要求有所不同，使用时荧光倒置显微镜和电脑成像软件之间需要不断地切换，同时图像采集时参数设置较多[5-9]，操作不当会对仪器造成较大的损伤，为此需要配备具有一定专业技术水平、责任心强的实验技术人员或教师担任操作管理人员，且须经过培训和考核方可上机操作。为了提高管理人员的专业素质和管理能力，管理人员应定期参加设备相关的操作技能培训，积极参加LSCM 研究领域的会议及论坛，以便和专业人士进行技术学习和交流，同时及时收集和归纳整理用户的反馈信息，总结仪器的使用情况并及时作出改进。

5.2 管理人员职责

激光扫描共聚焦显微镜仪器功能强大，应用广泛，如何更好地使用仪器，保证其正常安全运行的同时再开发其他功能和应用，技术人员起到了关键作用。其主要职责有：

（1）制定并执行FV3000 激光扫描共聚焦显微镜的操作规程，认真整理好设备的使用、维护和维修记录，并及时登录开放共享网络管理平台，填报仪器设备的管理及使用状况。

（2）在熟练使用FV3000 激光扫描共聚焦显微镜已有功能的基础上，合理开发新功能，使仪器设备发挥最大收益。

（3）按规定对FV3000 激光扫描共聚焦显微镜进行维护、维修、校验标定及档案管理工作。

（4）负责对校内和校外的服务及对使用人员的操作培训工作。

6 FV3000 网络预约使用及管理

大型仪器设备共享管理系统能够结合互联网技术，有效整合设备资源，打破科研单位界限，是仪器开放共享共用、提高仪器利用率的有效途径[10]。激光扫描共聚焦显微镜应用非常广泛，药学、医学、化学、生命科学等学科都会用到此类仪器。为了促进各学院学科的资源共享，提高大仪设备使用率，FV3000 已加入浙江大学大型仪器共享平台，实行网络化管理。校内外的研究人员可以登录浙江大学大型仪器共享管理平台（http：//equip.zju.edu.cn/xin/）查询到仪器型号、技术指标、应用范围、管理员、收费标准等信息，实行网络预约。操作人员可根据用户需求，对样本的预选、图像采集、显微图像分析等系列环节进行技术服务。网络平台上仪器使用预约一览表可以直观地查看仪器的预约使用情况，可以极大地解决仪器空置、使用时间冲突、使用率低等问题[11]。

7 FV3000 开放共享及有偿服务

FV3000 激光扫描共聚焦显微镜价格昂贵，运行成本和维修保养的费用都很高，且设备需要定期更换灯泡、矫正光路等，后期维修费用是否充足，直接影响设备的使用寿命。为保障大型仪器设备的良好运行，提高大型仪器设备的使用效益，规范大型仪器功能开发与维修保养服务，促进开放共享，更好地为教学、科研和学科建设服务，目前FV3000 已纳入国家大型设备平台开放共享管理系统，在满足校内教学科研基本需求的前提下，主动为社会提供分析测试、协作咨询、培训指导等共享服务工作，有效整合资源，促进社会共享。同时，FV3000 设备连接浙江大学有偿服务系统，根据有关文件制定收费标准，经学校实验室与设备管理处审核通过后，根据审定的标准开展大型设备后有偿服务，用户可通过线上、线下两种形式缴纳测试费用。有偿服务收入全部纳入学校统一财务账户管理，集中核算，同时根据服务收入设立大型设备专项维修基金，用于仪器日常运行及维修。

近年来，国家加大对科研的投入，促进高精尖仪器技术快速发展，科研工作者对共聚焦显微镜成像实验需求量在不断攀升，使得共聚焦扫描显微镜的数量和功能都在快速增长，如何管好、用好贵重仪器设备，保证其在稳定且高效运行的同时发挥与其价值相匹配的功能，更好地为教学和科研工作服务，提高设备使用效益和资源共享率，已成为众多高校乃至社会学术群体共同关注的问题。水稻重点实验室自购置FV3000 共聚焦显微镜以来，已为15 个院内外课题组的280 多位科研人员提供服务，年使用机时1800 h 左右，支撑国家级重大重点项目40 余项，发表高水平研究论文200 余篇，获省部级以上奖励8 项，为学科建设及发展提供了强有力的保障。