奶牛养殖中霉菌毒素的危害和脱毒技术

史 杰，李炳梅，王永梅，高素敏

1 新乡市畜产品质量监测检验中心，河南新乡 453003

2 利津县现代畜牧业发展服务中心，山东东营 257000

0 引言

霉菌是广泛存在于自然界中的真菌，种类繁多。一些真菌，如曲霉菌、镰刀菌和青霉菌等丝状真菌在生长繁殖过程中遇到外界环境适宜的温湿度条件，通过代谢产生霉菌毒素。霉菌毒素是一类低分子质量次级代谢产物，具有致癌性、致毒性、致畸性。目前所知，有大约300 种真菌能够产生有毒害的代谢产物，其中，黄曲霉菌素（Aflatoxin，AF）、伏马菌素（Fumonisins，FB）、玉米赤霉烯酮菌素（Zearalenone，ZEN）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Trichothecenes，DON）、T-2毒素、赭曲霉菌素A（Ochratoxin A，OTA）等是畜牧养殖业中危害最严重、最常见的霉菌毒素[1]。

饲料霉菌毒素污染是一个全球性的安全问题，全球每年约有25%的谷物受到已知霉菌毒素的污染，约有2%的农作物因污染严重而失去营养及经济价值[2]。我国畜牧养殖业中霉菌毒素污染饲料程度也比较严重，新修订的《GB13078—2017 饲料卫生标准》将上述6 种霉菌毒素列入饲料和饲料原料监测指标，作为判断饲料卫生标准。雷元培等[3]2020年，对国内各省区域的玉米、玉米副产物、小麦及麸皮、杂粕和全价饲料样品进行检测，AFB1检出率在87.05%～100.00%，ZEN的检出率在82.79%～100%，DON的检出率在87.44%～100%；玉米中AFB1污染最严重，玉米副产物中ZEN污染最为严重。与单胃动物相比，反刍动物的饲料及其原料种类多、来源广泛。农作物秸秆、籽粒玉米、小麦、高粱、稻谷、大麦等植物性饲料原料是奶牛的常规饲料原料，在种植、生长、收获、加工和储藏等过程中容易接触多种霉菌和受到多种霉菌毒素的污染。奶牛采食霉变饲料后，肝肾器官、生殖系统、免疫系统、神经系统、消化系统等均会受到霉菌毒素的损伤，奶牛的生产性能和乳品质量也会下降。应用霉菌毒素脱毒技术解决霉菌毒素污染，降低其毒性是非常必要的。

1 几种危害严重的霉菌毒素

1.1 黄曲霉毒素（AF）

AF是由黄曲霉菌、烟曲霉菌和寄生曲霉菌等菌株产生的一类理化特性和化学结构相似的次级代谢产物。其化学结构含一个氧杂萘邻酮（香豆素）和一个双呋喃环，易溶于丙酮和甲醇、氯仿等有机溶剂，不溶于水，遇强碱溶液（pH值9～10）很快分解，但在中性和酸性溶液中比较稳定；无嗅、无色、无味。AF主要有B1、B2、G1、G2、M1、M2和毒醇等20 多种类型[4]。不同的AF在紫外线下发出颜色不同的荧光，其中，AFB1和AFB2（B族AF）呈现蓝色光，AFG1和AFG2（G族AF）呈现绿色光，AFM1和AFM2（M族AF）呈现蓝紫色。在己发现的霉菌毒素中，AF的致癌性、致毒性、致突变性、致畸性均居首位[5]。1993年，AF被世界卫生组织（WHO）癌症研究机构划定为一类致癌物。其中，以AFB1的致癌性和毒性最强，对敏感动物的半致死量（LD50）为0. 294 mg/kg[6]，因此，通常把AFB1作为检测动物饲料和食品的主要指标。《GB13078—2017 饲料卫生标准》规定：AFB1在“玉米加红产品、花生饼”中的最高限量为≤50μg/kg，“其他植物性饲料原料”的最高限量≤30 μg/kg。高温潮湿的环境下，AF主要污染玉米及其秸秆、花生秧、花生饼、豆类等饲料原料。

1.2 玉米赤霉烯酮（ZEN）

ZEN最早在赤霉病的玉米作物上发现，是由木贼镰刀菌、禾谷镰刀菌、雪腐镰刀菌、燕麦镰刀菌等产生的甾体霉菌毒素，是一种二羟基苯酸的内脂结构，化学结构式为C18H22O5，难溶于水，易溶于碱性溶液，耐120 ℃高温。由于ZEN通过与雌激素受体（ER）竞争性的结合，使ER发生二聚化，进而激活雌激素反应元件产生拟雌激素效应，具有雌激素活性，可引起雌性畜禽发生雌性激素综合征，因此，ZEN也是一种主要损害奶牛生殖系统的雌激素霉菌毒素。此外，ZEN还具有DNA损伤毒性、细胞凋亡毒性、免疫抑制毒性和氧化损害毒性等[7]。镰刀菌主要存在于霉变的高粱、玉米、小麦和小米等谷物，在适宜的温湿度下滋生。《GB13078—2017饲料卫生标准》中规定“玉米及其加工产品”最高限量为≤0.5 mg/kg，其他植物性饲料原料最高限量为≤1 mg/kg。

1.3 赭曲霉毒素 A（OTA）

OTA是曲霉属和青霉属等产毒真菌的次生代谢产物，无色结晶化合物，其化学分子式为C20H18O6NCl，OTA不易降解，稳定性强，难溶于水，易溶于有机溶剂，广泛存在于饲料和饲料原料中，对畜禽肝肾、神经和免疫系统均有毒性、致癌、致畸和致突变等危害。异香豆素部分是OTA的主要毒性基团，苯丙氨酸部分的羧基和氯基是其毒性的主要原因[8]。《GB13078—2017 饲料卫生标准》中规定“谷物及其加工产品”和“配合饲料”的最高限量均为≤100 μg/kg。

1.4 脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）

DON化学名为3A，7A，15-三羟基-12，13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮，分子式为C15H20O6，属单端孢霉烯族化合物，是黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、燕麦镰刀菌等产毒真菌的次级代谢产物。DON是一种霉菌毒素，通常由镰刀菌属产生，并经常在谷物中检测到。该化合物在高浓度时表现出免疫抑制特性，在低浓度时表现出免疫刺激作用。这种霉菌毒素的其他作用包括下调参与蛋白质合成、增殖、核糖体蛋白质和线粒体的基因。《GB13078—2017 饲料卫生标准》中规定DON“植物性饲料原料”最高限量为≤5 mg/kg和“其他精料补充料、配合饲料”的最高限量均为≤3 mg/kg。

1.5 T-2 毒素

T-2毒素是单端孢霉烯族毒素之一，主要由镰孢菌属等多种真菌，为白色针状结晶物，易溶于甲醇、乙醇、丙醇等极性溶剂。T-2毒素具有强的细胞毒性，是A类单端孢霉烯族化合物中毒性最强的一种[9]。《GB13078—2017 饲料卫生标准》中规定T-2毒素在“植物性饲料原料”最高限量为≤0.5 mg/kg。

1.6 伏马毒素（FB）

FB由轮状镰孢菌、串珠镰刀菌、多誉镰刀菌等其他镰孢菌种产生的次级代谢产物，是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成结构类似的双酯化合物[10]。已发现有11 种伏马毒素，其中，FB1、FB2是污染玉米、小麦和高粱等农作物最常见的两种毒素，在天然污染的玉米中以FB1量最多，约占FB总量的70%[11]。《GB13078—2017 饲料卫生标准》中规定F（B1＋B2）“玉米及其加工产品、青贮饲料等饲料原料”最高限量为≤60 mg/kg，反刍动物精料补充料最高限量为≤50 mg/kg。

2 霉菌毒素对奶牛养殖业的危害

奶牛饲料原料中的玉米、小麦、稻谷、作物秸秆、苜蓿等植物性饲料，从田间生长、收割到储藏、加工各环节都存在AF的污染风险，并可以感染多种真菌菌株，产生多种霉菌毒素。而多种霉菌毒素通常会产生协同效应，从而对动物的免疫和健康造成更严重的毒性影响。一般来说，温度、干旱、潮湿、虫害、疾病等可以对植物造成物理损害或干扰植物生长的因素，都可能使作物更易受到AF污染。在气候方面，干燥和高温条件有利于AF污染的生长，而温暖和潮湿条件有利于成熟后的污染。FB、ZEN、T-2、DON容易在田间侵入作物茎叶和籽实；大部分霉菌在温度20～30 ℃、相对湿度70%～80%环境中生长滋生，如果储藏环境高温、潮湿和饲料含水量较高，饲料就会发生霉变。

霉菌毒素破坏饲料营养物质，降低其适口性，导致奶牛采食量下降以及出现消化机能和繁殖障碍，影响奶牛泌乳量和乳品质。霉菌毒素对动物身体的毒性程度主要取决于毒素的类型、数量、暴露时间以及动物的健康状况、性别、年龄、品种和其他因素。长期饲喂低浓度霉变饲料会导致奶牛慢性中毒，造成肝脏损伤，肝脏出血、病变，破坏免疫系统，形成免疫抑制，而饲喂高浓度霉菌毒素则引起急性中毒甚至死亡。奶牛中毒早期的症状主要表现为食欲不振、嗜睡、消瘦、血尿、呕吐、腹泻。笔者曾解剖数例中毒死亡的奶牛，发现多处器官病变，肝脏肿大，外观色泽发暗，表面布满出血点；消化道糜烂出血，真胃内淤血、水肿，黏膜大面积溃疡糜烂，小肠黏膜肿大出血、粘连严重，与车玉媛等[12]的文献报道一致。

当反刍动物摄入AF时，体内细胞DNA和RNA合成并与酶相互作用的能力受到抑制[13]。AF通过破坏瘤胃微生物的生长和功能，降低了奶牛的生产性能[14]。AFB1具有基因毒性、免疫毒性、致畸、致癌、致突变等毒性作用。其毒性机制包括诱导氧化应激、细胞毒性和DNA损伤。ZEN是一种雌激素性镰刀菌毒素，被归类为植物雌激素或真菌雌激素。其化学结构类似于天然雌激素，允许其与雌激素受体位点结合，导致雌激素性增强，因此，奶牛ZEN中毒最常导致生殖系统紊乱[15]。Coppock[16]研究发现，小母牛采食含有1.5 mg /kg ZEN及1.0 mg /kg DON的玉米后，会在2～5 d内频繁发情，与卵巢周期不同步，母牛在怀孕的第2～3个月也会有行为发情，即特发性阴道炎。AF对公牛精子、受精能力和植入前胚胎发育也有负面影响。Komsky-Elbaz等[17]报道，AFB1降低了公牛的精子活力，降低质膜完整性，同时也降低了精子的线粒体膜电位和DNA完整性。10 μM AFB1可能导致精子中345 个基因的差异表达，这些基因参与细胞途径，如胚胎和胎盘发育、细胞周期、DNA修复、组蛋白修饰和信号通路；也可通过诱导活性氧（ROS）的过量产生，损害卵母细胞和胚胎的着床前发育[18]。AFM1是AFB1的羟基化代谢产物，可在奶牛食用污染饲料后在牛奶中检出。由于AFM1的毒性作用，即使在低浓度下，AFM1也会导致致癌性、致突变性、遗传毒性、致畸性和免疫抑制。哺乳期奶牛摄入受污染的饲料后，AFB1在肝脏中被部分代谢和生物转化为AFM1，然后被排泄到牛奶中。由于其热稳定性，AFM1不能被普通食品加工程序降解或破坏。因此，牛奶及其乳制品中的AFM1残留被视为严重的公共卫生问题[19]。

3 霉菌毒素脱毒技术

3.1 物理吸附

在饲料中添加黏土矿物或矿物吸附剂是养殖场和饲料工业广泛采用的处理霉变饲料的方法。矿物吸附剂作为一种非营养添加剂添加到动物饲料中，可以防止结块形成（抗结块剂和凝固剂），结合或减少霉菌毒素，提高动物的生产性能。矿物吸附剂包括膨润土、沸石、蒙脱土和水合铝硅酸钠钙盐，由于其带负电荷（比如沸石一种微孔铝硅酸盐，是带负电荷的矿物质之一，能像磁铁一样吸吸附带正电荷的毒物，包括自由基、突变的细胞、重金属及其他毒素）和表面积孔隙体积大、较强的膨胀能力和离子交换能力，且可以通过化学修饰进一步提高霉菌毒素的吸附能力，能够结合或吸附霉菌毒素到它们的结构空间、外表面和边缘，以降低接触霉菌毒素的风险，因此在畜牧生产中广泛使用。然而，这些吸附剂也可能对动物造成不良影响，如饲粮中添加2.5%和5.0%蒙脱石的猪出现了肝脏组织学变化，包括肿胀、空泡和囊泡变性，且与对照组相比，抗氧化能力、谷胱甘肽过氧化物酶和平均日采食量均受到严重影响[20]。

酵母细胞壁（YCW）主要成分是碳水化合物，属于一组低聚糖，主要包括β-葡聚糖和甘露寡糖（MOS）。据估计，YCW含有85%～90%的寡糖，相当于1，3-β-葡聚糖（30%～50%）、1，6-β-葡聚糖的分子（5%～10%）、甘露糖蛋白（30%～40%）和甲壳素（1.5%～6.0%），能够与特定霉菌毒素（如AF、OTA和ZEN）发生吸附反应，改善畜禽肠道健康，提高生产性能[21]。

3.2 生物降解

生物降解霉菌毒素是一种非常可行的饲料净化方法。物理方法和化学方法在去除霉菌毒素的同时，也可以去除或破坏营养物质。近年来，微生物降解技术因具有高效、低毒、特异性强、不损伤营养物质的处理潜力，被广泛应用于食品和饲料行业。Chen等[22]从自然发酵泡菜中分离筛选出的淀粉芽孢杆菌（WF2020）在37～45 ℃，pH为8.0环境下能有效降解1～8μg /mL的AFB1，由于淀粉芽孢杆菌（WF2020）具有合成活性化合物、缺乏毒力基因、对多种抗生素敏感等优点，被认为是一种潜在的益生菌。Imade等[23]研究了山东玉米地分离的肺炎克雷伯菌GS7-1菌株在ZEN上的降解能力，发现ZEN去除率随pH值的增加而增加；当pH值从5增加到8时，ZEN去除率从61.3%增加到100%；随着培养时间的增加，ZEN在96 h时被完全降解，降解效果增加。肺炎克雷伯菌GS7-1降解ZEN的最低和最高温度分别为28 ℃和60 ℃。此外，菌株GS7-1的发酵物上清液可以使ZEN含量降低100%。Zheng[24]从驴肠食糜中分离到一株具有较强OTA 解毒能力的粪产碱菌ANSA176，在37 ℃条件下，12 h内可将97.43%的1 mg/mL OTA降解为赭曲霉毒素α（OTα），而OTα毒性仅为OTA的1/500。

3.3 化学脱毒

化学脱毒方法主要有碱处理法、酸处理法、氨处理法及有机溶剂（如95%乙醇、90%乙酮等）处理法等，是在饲料中添加强酸、强碱或氧化剂使霉菌毒素转化为无毒的物质。例如，在室温下用3～5 mol/L的盐酸处理AF，可使其减少78.0%和99.6%，在氢氧化钠溶液中则可以迅速水解生成溶于水的邻位香豆素钠盐，进而水洗去除[25]。化学脱毒方法效果比较明显，但是其对饲料有腐蚀性，破坏营养成分，降低畜禽的适口性，因此，在实践中应用较少，一般用于严重霉变难以脱毒的饲料。

4 小结

霉菌毒素是奶牛养殖中威胁饲料安全、奶牛健康和乳品质量的重要风险因子。目前我国奶牛养殖业存在霉菌毒素污染饲料的情况比较严重，应重视这方面的综合防控工作，在饲料及饲料原料生产、加工、饲喂等各环节预防霉变发生，应用脱霉技术最大程度减少霉菌毒素的危害。物理吸附法和生物脱毒法具有独特的脱毒技术优势，前景广阔，值得技术研究开发和推广。