门静脉成纤维细胞有望成为可再生肌成纤维细胞的新来源

马鸿倩 鄢和新

作者单位：200127 上海交通大学医学院附属仁济医院麻醉科

多种肝脏疾病如慢性肝炎和胆汁淤积性肝损伤都会通过纤维化途径导致肝硬化，但不同肝损伤最初表现出的纤维化模式不尽相同。例如，在胆汁淤积性疾病如原发性胆管炎和原发性硬化性胆管炎中，纤维化起初仅分布在门静脉周围，而酒精相关性肝病显示纤维物质沉积在中心静脉和肝窦周围[1]。这些不同的纤维化模式表明，发生在不同位置的细胞特异性损伤可能与表型独特的成纤维细胞相互作用，启动不同的信号通路。

肝脏间充质细胞由位于肝窦的HSCs和血管周围细胞组成，包括门静脉和中央静脉周围的血管平滑肌细胞和成纤维细胞。这些间充质细胞来源于胚胎横隔间充质(STM)[2]，STM诱导腹侧前肠内胚层扩张形成肝芽。原始肝细胞长入间充质，形成肝窦状结构；位于肝细胞和肝窦内皮细胞之间的间充质细胞最终将发育成HSCs[3]。贯穿于发育中的肝芽静脉分支，即新生的门静脉系统，通过导管板的形态发生，驱动肝母细胞分化形成胆管细胞。肝内动脉分支沿着新生的肝内胆管分支，从发育中的肝脏中央区域延伸到周围区域，嵌入肝脏间充质，形成由门静脉、肝动脉和总胆管组成的门静脉三联体。

在过去的30年里，HSCs因具有向肌成纤维细胞分化的能力而被广泛研究。HSCs是一种处于静息状态的、富含维生素A的间充质细胞，是第一个被鉴定为肝损伤时肌成纤维细胞来源的细胞[4]。随着HSC分离技术的改进，许多研究确定了HSCs是肝纤维化中肌成纤维细胞的主要来源。最近的一项研究根据HSCs在肝细胞癌发生、发展不同阶段的作用将其分为两类亚群，即静止的、产生细胞因子的HSC(cyHSCs)和激活的肌成纤维细胞(myHSCs)。cyHSCs通过产生肝细胞生长因子HGF保护肝细胞免于死亡，在肝细胞癌初期抑制肿瘤发展；myHSC通过产生Ⅰ型胶原蛋白形成纤维化微环境，在肝细胞癌后期促进肿瘤发展[5]。

越来越多的证据表明，其他肝脏间充质细胞(尤其是门静脉间充质细胞)也可以生成肌成纤维细胞，这些细胞受到了越来越多的关注[6-9]。事实上，早在几十年前Schaffner等[10]就发现了位于肝窦以外的肝间充质细胞，使人们认识到肝成纤维细胞空间分布的特异性。门静脉成纤维细胞(PFs)的空间定位使它们成为胆管纤维化的介质，2002年Kinnman和Housset[11]首次提出PFs是胆道纤维化的第一反应者，随后被肝星状细胞(HSCs)取代。此外，十多年前Dranoff和Wells[12]系统地讨论了PFs在肝纤维化发生中的作用，并提出了需要进一步探索的领域。

对于门静脉成纤维细胞的研究主要瓶颈在于缺乏可以分离或在体内示踪门静脉成纤维细胞的表面标志物。Mourabi等[3- 4, 12]从大鼠肝脏胆道血管树片段成功分离了门静脉肌成纤维细胞，与肝干细胞不同，门静脉间充质细胞可以产生高度增殖的、具有促血管生成特性的COL15A1+肌成纤维细胞。然而，在这些研究中门静脉肌成纤维细胞的前体细胞尚未被真正确定。为此，Lei[11]从胆道血管树分离并分选出门静脉间充质细胞，使用生物信息学分析来进一步定义门静脉间充质的细胞组成，确定了区分肌成纤维细胞亚群的标志物，并确定了PFs在小鼠和人类肝病病理中的作用。

为了确定门静脉间充质细胞的组成，Lei等[13]从健康小鼠的胆管树中分离出单细胞悬液，通过细胞分选富集了胆管细胞、内皮细胞和造血细胞谱系标志阴性的细胞，再对这些富集之后的门静脉间充质细胞进行单细胞RNA测序。无监督聚类分析发现了16个细胞群，其中包括可能来自Glissonean 肝蒂的间皮细胞，以及四个在分选过程中被遗漏的内皮细胞群。在间充质细胞成分中，他们确定了五个不同的成纤维细胞群和血管平滑肌细胞群，以及一个HSCs群。五个纤维细胞群均表达细胞外基质蛋白(包括几种胶原蛋白)。然而，这些成纤维细胞群所展示出的独特表达谱，暗示在纤维化形成过程中这些细胞具有不同的命运。例如，成纤维细胞群5与HSCs拥有共同的基因表达谱，表明该群可能是PFs和完全分化的HSCs之间的中间体。根据单细胞熵的测量，基于其信号混杂程度近似单细胞的分化潜能和可塑性，成纤维细胞群3和4被认为是潜在的前体细胞[14]。使用轨迹分析和GO分析对成纤维细胞、VSMC和HSC群以及干细胞标志物表达的分析，进一步支持成纤维细胞群3和4具有间充质干细胞多系分化的潜能和特征。这群细胞被称为具有间充质干细胞特征(PMSCs)的PFs。这一研究揭示了门静脉间充质复杂的细胞组成，并确定了可能是门静脉肌成纤维前体细胞的细胞群。

细胞培养研究表明，PFs具有高度克隆性，表达间充质干细胞标志物，并能进行三系分化(间充质干细胞的一个特征)。与悬浮培养相比，在基质上平面培养时这些细胞会表现出门静脉肌成纤维细胞的特征。因此，上述筛选策略和分离步骤确定了可能是门静脉肌成纤维细胞前体细胞的PMSCs。随后作者对静止状态的PMSCs和HSCs，以及两者转分化后形成的肌成纤维细胞进行群体 RNA测序，以寻找能够划分这两种细胞群在静止和肌成纤维状态下的差异基因，从而用于肝脏纤维化组织分析。在向肌成纤维细胞分化的过程中，PMSCs在培养中是克隆性的，而HSCs则无分裂能力。转录组分析结果提示，Slit2是PMSC/PMSC-MF的特征基因，在PMSCs向肌成纤维细胞分化过程中始终稳定表达，而在其他肝细胞类型，例如HSCs/HSC-MFs中几乎没有表达。体外研究发现，PMSC来源的Slit2可激活HSCs并促进内皮细胞血管新生。荧光原位杂交分析表明，在小鼠肝病模型和人类肝硬化样本中，SLIT2+PMSC来源的肌成纤维细胞在纤维化隔膜中沿着新生血管聚集，并被SLIT2-HSCs来源的肌成纤维细胞所包围。因此Lei等认为，PMSCs的增殖可以促进血管新生和HSCs来源的肌成纤维细胞的累积。他们确定了PMSCs的标志物，明确了小鼠和人类肝脏样本中门静脉肌成纤维细胞的解剖分布和来源。PMSCs标志物可用于确定纤维化肝病中存在的肌成纤维细胞的类型，以及这些肌成纤维细胞如何在疾病不同阶段对不同损伤做出反应，进而促进肝脏纤维化的形成。此外，这项发现还有助于研究不同纤维化细胞群与胆管细胞之间潜在的信号网络。原发性硬化性胆管炎的组织学特点是管周和桥状纤维化，这一病理过程可能同时或先后涉及PFs和HSCs[15]。最近有研究发现，原发性硬化性胆管炎中的胆管细胞对损伤的反应不一致。在受到损伤后，一些胆管细胞的细胞周期停滞(即衰老)，而其他胆管细胞发生导管反应并开始增殖[16]。这种对应激反应的差异及其与原发性硬化性胆管炎发病机制的关系仍不清楚。有数据表明，在疾病初始阶段，活化的PFs是被招募到胆管周围损伤部位的主要成纤维细胞类型，衰老胆管细胞相关的分泌表型可能在胆管周围使PFs持续活化导致管周纤维化。当胆管反应的胆管细胞增殖超出原来的胆管结构时，HSCs的大量聚集可能导致疾病晚期实质桥接性纤维化。即衰老胆管细胞和PFs主要参与胆道周围纤维化的发展和持续，而胆管反应性细胞和HSCs则参与实质纤维化的形成[17]。PMSCs的门静脉定位使其成为胆汁纤维化的诱因，这可能涉及与其他细胞如胆管细胞、肝细胞、VSMCs及免疫细胞之间的细胞信号串扰。综上，通过结合标准化的特征性标志物用于区分HSCs和PFs在不同病因下导致纤维化的差异，为进一步的研究奠定了基础。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。