非编码RNA在骨关节炎中的研究进展

李震，李泽晖，孙赫，魏锦强，曾宪中，王小超，万超，曹学伟*

(1.广州中医药大学，广东 广州 510405；2.广东省中医院，广东 广州 510120；3.香港中文大学，香港 999077)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种与年龄相关的慢性、进行性和退行性关节疾病，影响着全球数以千万计的中老年患者[1]。其主要特征包括关节软骨退化、软骨下骨增厚、滑膜炎症和骨赘形成，主要症状是疼痛、僵硬和活动受限[1-2]。它不仅给患者带来了巨大的痛苦，降低患者的生活质量，而且增加了社会经济负担[3]。近年研究对OA表观遗传调控机制的关注，揭示了非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)在调节软骨细胞与细胞外基质平衡方面的潜在重要作用。

其中，微小RNA(microRNA，miRNA)是一种小单链ncRNA分子，通常长22～24个核苷酸，通过与靶基因的3'-UTR结合参与RNA沉默和转录后基因表达调控，导致信使RNA(messenger RNA，mRNA)降解增加或最终抑制蛋白质合成[4]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)为长度超过200个核苷酸的由RNA聚合酶Ⅱ合成的ncRNA，几乎没有蛋白质编码潜力[5]。环状RNA(circular RNA，circRNA)作为一种新型的ncRNA，由特殊的前体mRNA通过可变剪接产生的，广泛存在于原核生物和真核生物中，为不具3'和5'末端头尾的共价闭环结构，在生物体中稳定表达[6]。大量研究证实[5-7]，ncRNA(miRNA、LncRNA和circRNA)在转录、转录后和翻译后水平的各种生物过程的调控中发挥着重要作用。值得注意的是，ncRNAs的变化参与了软骨细胞炎症、凋亡和细胞外基质代谢的调节，在OA的发生发展过程中也起着重要的作用。本文总结了导致OA发展的ncRNA调控机制的最新研究进展，将为阐明OA的发生发展提供更全面的依据。

1 miRNAs与OA

miRNA是研究最广泛的ncRNA类别，其特征是不断增加的22～24个核苷酸长的非蛋白质编码RNA。miRNA通过与靶基因mRNA的互补碱基配对来调节其靶基因的表达。大量研究揭示了OA发病期间软骨细胞中miRNA的异常水平，其中大多数在表观遗传、转录和转录后水平上功能性地参与软骨细胞的炎症反应、凋亡和基质代谢。

1.1 miRNAs调控OA中的炎症 Chang等[8]报道在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的ATDC5细胞中，miR-486-5p上调，红细胞衍生核因子2相关因子1(nuclear factor erythroid 2 like 1，NRF1)下调。miR-486-5p被验证直接靶向和调节NRF1的表达。抑制miR-486-5p可显著改善细胞增殖，减少细胞凋亡，减弱炎性细胞因子的产生，调节超氧化物歧化酶和乳酸脱氢酶的水平。此外，随着NRF1的下调，miR-486-5p对LPS诱导的细胞损伤的影响减弱。总之，抑制miR-486-5p通过靶向NRF1减轻了LPS诱导的ATDC5细胞损伤，包括炎症损伤、氧化应激和细胞凋亡。因此，NRF1可以作为OA的新治疗靶点。Jiang等[9]研究发现，山奈酚通过下调miR-146a保护ATDC5软骨细胞免受LPS引发的炎症损伤。Jin等[10]发现miR-467b过表达显著降低了LPS处理诱导的白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的产生，但被信号转导和转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)的过表达逆转，说明miR-467b通过靶向ATDC5细胞中的STAT1减轻LPS诱导的炎症。Xiao等[11]报道miR-613通过靶向纤连蛋白1减轻IL-1β诱导的软骨CHON-001细胞的损伤，因此，miR-613可能是治疗OA的潜在选择。Zhang等[12]发现miR-130b在骨髓间充质干细胞和OA软骨细胞的软骨分化过程中分别首先增加和急剧减少，而IL-1β刺激导致软骨细胞中miR-130b表达增加。miR-130b抑制剂促进骨髓间充质干细胞的软骨分化和软骨细胞生长并抑制炎症因子的水平。以上研究均表明，miRNAs多与其靶基因形成调控轴，通过减弱炎性细胞因子的产生、促进细胞增殖及抑制凋亡等途径参与调节OA中的炎症反应。

1.2 miRNAs调控OA中的细胞凋亡 Wan等[13]发现，miR-152的上调提高了软骨细胞的活力，减少了细胞凋亡并平衡了体外细胞外基质的分解代谢和合成代谢因子，生物信息学分析表明转录因子-4(transcription factor-4，TCF-4)是miR-152的靶基因，因此，miR-152通过TCF-4通路减弱骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡和软骨退化。Wen等[14]报道，miR-455-3p通过调节磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidyl alcohol kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)通路减少细胞凋亡并减轻软骨细胞变性。Chen等[15]报道miR-129-3p通过靶向胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白1(cytoplasmic polyadenylation element binding protein 1，CPEB1)减轻膝关节骨折诱导的骨关节炎软骨细胞凋亡。Sun等[16]报道miR-93-5p在OA中下调可能通过靶向LncRNA肿瘤易感性候选基因2(long non-coding RNA cancer susceptibility candidate 2，LncRNA CASC2)抑制LPS诱导的软骨细胞凋亡。调控细胞凋亡的基因数量众多，调控网络中任何关键节点的变化都可能影响最终细胞凋亡的产生和发展，miRNAs能够直接靶向调控凋亡因子的表达，影响细胞凋亡进程。一些miRNAs主要作用于促凋亡基因对凋亡产生抑制作用，而另外一些miRNAs则针对性地负调控凋亡基因促进细胞的凋亡。

1.3 miRNAs调控OA中的细胞外基质(extracellular matrix，ECM) Bai等[17]研究发现miR-122的过表达增加了ECM分解代谢因子的表达，并抑制合成代谢基因的表达；miR-122表达的抑制具有相反的效果。此外，沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)被确定为miR-122的直接靶标。因此，miR-122/SIRT1轴调节骨关节炎中软骨细胞的细胞外基质降解。Xiang等[18]发现miR-142-5p的过表达通过抑制软骨细胞凋亡减轻了OA病理，即使在CXC族趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)过表达的OA软骨细胞中也是如此。这与软骨基质降解减少、软骨炎症减少和有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路失活有关。因此，CXCR4靶向miR-142-5p的上调表达可以抑制OA软骨细胞的细胞凋亡、炎症和基质分解代谢，并使MAPK信号通路失活。An等[19]报道miR-203a的下调通过Smad3信号传导抑制人软骨细胞中IL-1β诱导的炎症和软骨降解。Tu等[20]发现miRNA-377-3p通过下调整合素α6(integrin α6，ITGA6)减轻IL-1β引起的骨关节炎软骨细胞凋亡和软骨降解。在生理情况下，软骨细胞基质合成与分解代谢动态平衡的细胞因子可通过调控软骨细胞生理功能，参与免疫应答和介导炎性反应等。当关节软骨损伤时，炎性信号通路被激活，导致炎性因子IL-1β、TNF-α、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)等激活ECM降解酶，如：基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif，ADAMTS)等，参与软骨基质Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的降解，从而促进OA的进展。

相关研究表明，miRNA调控网络在表观遗传学、相关靶基因的表达、细胞通路等方面起着重要作用。大量研究证实在OA病理进程中，miRNA表达谱会发生变化，从而发挥不同的调控作用。本课题组前期高通量测序结果显示，OA患者软骨细胞中有53个表达异常的基因，其中34个上调，如：miR-3622b-3p、miR-129-2-3p和miR-585-3p等；19个下调，如miR-383-5p、miR-548ap-3p和miR-378e等。关节液中稳定存在的miRNA，具有成为诊断OA的生物学标志物的巨大潜力。有体内外研究证实，通过干预miRNA可以抑制软骨退变，因此其可作为OA的潜在治疗靶点。随着对miRNA不断深入的研究，一定可以大大推动OA的诊断和治疗。

2 IncRNA与OA

LncRNA是一种长度超过200个核苷酸的非编码转录物，其异常表达与多种人类疾病有关。在OA的发展过程中，IncRNA可通过招募相关蛋白调控基因转录、参与调控细胞信号通路、作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)靶向相关miRNA或直接靶向mRNA等方式发挥调控作用。

2.1 IncRNA调控OA中的炎症 在早期阶段，OA已经具有不同程度的炎症性表现。Luo等[21]研究发现MFI2-AS1的敲低通过增加miR-130a-3p和减少TCF-4增加了细胞活力，但抑制了LPS处理的软骨细胞的细胞凋亡、炎症反应和细胞外基质降解。表明敲低LncRNA MFI2-AS1通过miR-130a-3p/TCF-4抑制LPS诱导的骨关节炎进展。Wang等[22]发现LncRNA THUMPD3-AS1的过表达减轻了细胞凋亡并促进了炎症反应，而敲低具有相反的效果LncRNA THUMPD3-AS1显著增加细胞周期蛋白E2、细胞周期蛋白依赖性激酶4、B细胞淋巴瘤2、TNF-α、一氧化氮和IL-6水平，并降低caspase-3水平。Zhang等[23]报道miR-6891-3p通过靶向Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)抑制巨噬细胞增殖、迁移和炎症反应，而LncRNA IGHCγ1通过巨噬细胞中的核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号作为miR-6891-3p的ceRNA促进TLR4表达。表明LncRNA IGHCγ1通过调节巨噬细胞中的miR-6891-3p/TLR4/NF-κB轴来调节炎症反应。Xie等[24]发现在C28/I2细胞中，母本表达的8个小核仁RNA宿主基因(maternally expressed 8，small nucleolar RNA host gene，MEG8)表达的沉默显著触发了IL-1β诱导的增殖抑制、细胞死亡和炎症反应。然而，转染MEG8显示出不利影响，说明LncRNA MEG8在骨关节炎中下调并调节软骨细胞增殖、凋亡和炎症。炎症是OA关节疾病的重要标志，随着对OA的进一步研究，LncRNA广泛参与其炎症信号通路的全过程，且在骨关节组织中呈差异表达。

2.2 IncRNA调控OA中的细胞凋亡 Fan等[25]研究发现与使用小干扰RNA阴性对照(si-NC)转染相比，LINC00473敲低可显著减少IL-1β刺激的C28/I2细胞中软骨细胞凋亡和促炎细胞因子的产生。并且，LINC00473通过miR-424-5p/淋巴细胞抗原6复合物E(lymphocyte antigen 6 complex，locus E，LY6E)轴促进软骨细胞凋亡和促炎细胞因子的产生，从而加剧骨关节炎的发展。Wang等[26]发现阻断Lnc HOX通过调节miR-222/ADAM10轴保护人类软骨细胞免受IL-1β诱导的细胞凋亡、ECM降解、炎症反应和氧化应激。Zhang等[27]发现Lnc生长抑制特异性基因5(growth arrest-specific transcripts 5，GAS5)过表达增加了软骨细胞中Smad4的表达。相比之下，miR-146a过表达下调了软骨细胞中的Smad4。此外，Lnc GAS5和Smad4过表达抑制LPS诱导的软骨细胞凋亡，而miR-146a过表达起相反的作用并减弱Lnc GAS5和Smad4过表达对细胞凋亡的影响。Nie等[28]发现LncRNA CALML3-AS1靶向miR-146a来调节软骨细胞凋亡。Zhou等[29]发现LncRNA CASC19通过调节miR-152-3p/DEAD-box解旋酶6(DEAD-box helicase 6，DDX6)轴加速软骨细胞凋亡和促炎细胞因子的产生以加剧骨关节炎的发展。

2.3 IncRNA调控OA中的ECM ECM具有保护软骨细胞免受机械应力破坏的作用，其合成和分解代谢的动态平衡维持着正常关节的完整功能，而ECM代谢平衡依赖于各种细胞因子的调节。Chen等[30]研究发现SHNG15过表达显著抑制ECM降解并促进OA软骨细胞的软骨细胞形成，LncRNA SNHG15通过调节细胞外基质稳态缓解骨关节炎进展。Chen等[31]发现LINC00671的过表达导致软骨细胞增殖受抑制、细胞凋亡增强和ECM降解，这很容易通过沉默onecut2或smurf2来逆转。此外，LINC00671通过smurf2诱导糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)泛素化并上调β-catenin表达。体内实验表明LINC00671或GSK-3β激活剂的沉默导致ECM降解减轻并改善OA进展。Liu等[32]报道IncRNA核富集转录体1(nuclearenrichedabundanttranscript1，NEAT1)靶向miR-193a-3p，miR-193a-3p靶向性别决定区Y框蛋白5(sex determinant Y box protein 5，SOX5)。抑制miR-193a-3p可逆转NEAT1介导的炎症反应、细胞凋亡和细胞外基质的降解。SOX5消除了miR-193a-3p上调对软骨细胞炎症、细胞凋亡和细胞外基质产生的影响。总之，NEAT1/miR-193a-3p/SOX5轴调节人类OA中的软骨基质降解。由此推断，LncRNA对软骨ECM起到重要调控作用，对OA患者关节的破坏密切相关。

综上所述，LncRNA作为调节基因表达的研究热点，可能通过调控软骨细胞炎症、细胞凋亡和软骨基质代谢等对OA的发病进程发挥关键的调控作用。研究发现LncRNA在表观遗传、转录和转录后水平上的调控过程均发挥重要作用，进一步研究证实LncRNA的表达高低将影响OA的病理进程。深入的研究正在逐渐揭示数量庞大且功能复杂的IncRNA家族的面纱，但目前对其如何调控OA的具体作用机制仍然存在很多疑惑。因此，进一步探讨LncRNAs在软骨和OA中的调控作用至关重要，有助于开发其在OA诊断和治疗方面的应用潜力。

3 circRNA与OA

circRNA是一类ncRNA，其特点是共价闭环结构，既没有5'帽子结构，也没有3'poly(A)结构。它们由前体mRNA的反剪产生，并在高度保守、稳定和组织特异性的哺乳动物中广泛表达。最近的研究表明，circRNA可以竞争性地相互作用并抑制miRNA海绵在其下游功能中的作用。因此，circRNA的作用及其潜在的miRNA调节剂被用来描述OA的分子机制和治疗OA的治疗靶点。

3.1 circRNA调控OA中的炎症 炎症可以促进细胞软骨的降解，加重骨关节炎患者的病情，传统的炎症因子主要有IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-6等，许多研究发现circRNAs调控骨关节炎进程与这些因子密切相关。circ_0128846沉默增强了细胞活力，但降低了细胞凋亡率和炎症反应，这被miR-140-3p敲低逆转。Janus蛋白酪氨酸激酶2(Janus kinase 2，JAK2)的过表达逆转了miR-140-3p对细胞表型的影响。circ_0128846沉默通过上调OA细胞中的miR-140-3p和下调JAK2来抑制MMP-13的水平并促进II型胶原的表达。动物实验结果表明，circ_0128846沉默通过调节 miR-140-3p/JAK2轴促进Ⅱ型胶原蛋白表达并减弱OA进展。circ_0128846通过充当miR-140-3p的海绵RNA来促进OA的发展，从而增加JAK2的表达。结果表明，靶向circ_0128846可能具有缓解OA进展的潜力[33]。Zheng等[34]研究发现circ_0116061和smurf2在OA软骨组织中高表达，miR-200b-3p低表达。敲低circ_0116061可以促进OA软骨细胞的增殖并抑制其凋亡和炎症。miR-200b-3p可以被circ_0116061吸收，其抑制剂可以逆转circ_0116061沉默对OA软骨细胞生物学功能的调节。Smurf2是miR-200b-3p的靶标，其表达受circ_0116061的正调控。Smurf2的沉默还可以增强OA软骨细胞的增殖并抑制其凋亡和炎症。此外，smurf2过表达也可以逆转circ_0116061沉默对OA软骨细胞生物学功能的调节。所以，circRNA与OA炎症的病理进程有着密切联系。

3.2 circRNA调控OA中的细胞凋亡 Huang等[35]机制研究表明，circRNA_0092516与miR-337-3p结合，干扰circRNA_0092516通过miR-337-3p/蛋白酪氨酸磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)轴促进软骨细胞增殖并抑制细胞凋亡，从而改善OA。体内实验阐明circRNA_0092516通过miR-337-3p调控软骨生成。总的来说，对circRNA_0092516的干扰通过miR-337-3p/PTEN轴促进了软骨细胞增殖并抑制了细胞凋亡，最终减缓了OA的进展。Zhou等[36]研究发现环状RNA circANKRD36通过靶向miR-599来调节Casz1以防止骨关节炎软骨细胞凋亡和炎症。Shi等[37]发现circSEC24A的过表达通过减少细胞增殖和增加软骨细胞的凋亡和炎症来促进IL-1β诱导的损伤。circSEC24A通过调节miR-142-5p/SOX5轴促进IL-1β诱导的软骨细胞凋亡和炎症。另外，circ_0134111敲低通过circ_0134111-miR-515-5p-SOCS1网络减轻IL-1β诱导的人软骨细胞凋亡、炎症和细胞外基质降解[38]。

3.3 circRNA调控OA中的ECM Bai等[39]研究发现circTMBIM6和MMP-13在骨关节炎患者软骨组织中的表达水平高于正常组，而miR-195在骨关节炎患者软骨组织中的表达水平较低。IL-1β和TNF-α处理后，软骨细胞中circTMBIM6和MMP-13的表达增加，而miR-27a的表达降低。circTMBIM6过表达降低了miR-27a的表达，但增加了MMP-13的表达。circTMBIM6基因敲除显示出相反的效果。Zhang等[40]发现circSERPINE2过表达减轻了IL-1β引起的细胞凋亡和细胞外基质降解。miR-495被circSERPINE2靶向并在OA患者和IL-1β处理的软骨细胞中上调。miR-495上调逆转了circSERPINE2介导的细胞凋亡和细胞外基质降解抑制的过度表达。miR-495靶向转化生长因子β受体2(transforming growth factor beta receptor 2，TGFBR2)，在OA患者和IL-1β处理的软骨细胞中低表达。源自SERPINE2基因的circSERPINE2可以通过与miR-495结合介导TGFBR2表达。总之，circSERPINE2通过调节miR-495/TGFBR2轴减弱IL-1β引起的软骨细胞凋亡和细胞外基质降解。

已有许多研究证实circRNA参与了OA密切相关的软骨细胞EMC的降解、OA软骨细胞的增殖、凋亡和自噬、OA软骨细胞的炎症反应等病理进程，这说明circRNAs有可能作为诊断和治疗OA的新靶点。近几年，circRNA已经成为各个学科领域研究的热点，但是在骨关节炎病理进程中，是否伴随特异性circRNA表达的调控，circRNA-miRNA-mRNA之间具体的调控网络轴，LncRNA与circRNA之间的调控关系以及circRNA自身表达高低的调控机制都不明确，因此，进一步的研究探索circRNA的调控机制必不可少。

4 小结与展望

ncRNA在RNA中占有很大的比重，之前错误的认为ncRNA无实质性的功能，但是近年来随着研究的不断深入，越来越多的ncRNA被证实在生物体的生长、发育和病理过程中发挥着至关重要的作用。本研究综述了近些年miRNA、LncRNA和circRNA在OA病理进程炎症反应、细胞凋亡和细胞外基质中的重要调控作用，随着研究的不断深入及越来越多的新的ncRNA被发现，将对OA基因表达调控网络的认识有了较大提升。大量的体内外研究已经证实在OA的病理进展中，许多ncRNA表达谱会发生显著改变，并对OA的发展起到不同的调控作用，通过对ncRNA的干预可以影响疾病的进程，这可能成为未来逆转OA进展的潜在治疗方法。虽然，ncRNA的发现使人们对基因调控机制的认知更加清晰，但由于其具有高度的表达特异性使其作用机制多样化。目前关于OA发病机制的研究仍处于初步探索阶段，随着ncRNA在OA的深入研究，阐明ncRNA在细胞中的分布，是否涉及上、下游拮抗剂协调作用为OA的诊断及潜在生物标志物或治疗靶标提供新的思路。

总之，OA的发病机制受多种因素影响，众多的ncRNA组成的调控网络发挥的生物功能及调控机制极其复杂，目前尚不能详细阐明ncRNA在OA中组成的调控网络所发挥的生物学功能及调控机制。因此，进一步研究ncRNA在OA中的分子机制和作用，不断阐明ncRNA的功能、ncRNA之间以及它们和DNA之间的相互作用，不仅可以加深对OA的发病和发展的认识，而且对于发现治疗靶点和疗效更好的药物也具有重要意义。