非编码RNA在缺血性脑卒中的作用机制研究进展

曾名望, 钟瑞蓬, 蓝青海, 王钰菲, 张文福, 杨 超综述, 梁伟东审校

非编码RNAs (non-coding RNAs,ncRNAs)是指基因组转录产生的一类不编码蛋白质的RNA分子,是一类内源性表达的RNA分子,主要包括miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA等,在机体多种病理生理过程中发挥着重要的调控作用。缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)是由于脑的供血动脉狭窄或闭塞,使得脑血流减少或中断、脑组织缺血缺氧导致脑组织坏死、神经功能受损或丧失的一类高发病率、高致残率、高致死率的疾病[1]。目前急性缺血性脑卒中的主要治疗方法是通过静脉注射重组组织纤溶酶原激活剂(rt-PA)进行溶栓,然而常常因为治疗时间窗过短,使得脑卒中的临床治愈水平受到限制。同时,血流再通后的缺血再灌注(ischemia-reperfusion injury,I/R)会加重脑损伤,严重影响患者预后。因此,深入研究IS发生、发展及治疗过程中的病理生理调控具有重要意义。近年来,许多研究报道非编码RNAs通过多种途径,如细胞凋亡、氧化应激、小胶质细胞的活化、血管内皮细胞的再生等在IS中发挥着重要的调控作用,本文就非编码RNAs在IS的具体调控机制研究进展做一综述,旨在为IS的防治研究提供参考。

1 概 述

非编码RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs)是指由基因组转录而成的不编码蛋白质的RNA分子。非编码RNAs可分为两种主要类型：基础结构型ncRNAs和调控型ncRNAs。调控型ncRNAs又分为非编码小RNA、长链非编码RNA(lncRNA)和环状RNA(circRNA),非编码小RNA包括microRNA(miRNA)、siRNA和piRNA。miRNA是一类长约22个核苷酸序列的内源性表达的非编码短单链RNA,在3’非翻译区(UTR)与mRNA不完全碱基配对，抑制蛋白质翻译,从而控制细胞的增殖、分化和凋亡等[2]。lncRNA是一种大于200个碱基数、在机体内转录但基本不翻译的一种非编码RNA,在机体内主要是通过干扰下游基因转录、阻断信号通路、引导转录因子与DNA序列结合或作为竞争性内源性RNA (ceRNA)调节mRNA的翻译等发挥作用[3]。circRNA是一类环形分子,结构由共价键形成,通常具有稳定的结构,不容易受RNA外切酶影响,同时具有高度的组织特异性表达,可作为miRNA海绵、转录调节剂等发挥作用[4]。脑卒中是全球范围内导致残疾和死亡的重要病因,可分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中两种类型,其中缺血性脑卒中占所有脑卒中的87%,它是一类血液循环障碍性疾病,是由于脑供血动脉狭窄或闭塞、脑供血不足导致脑组织坏死,引起相应的神经功能障碍。大量研究表明在脑卒中患者中ncRNAs的表达发生了改变[5]。越来越多的研究证实在缺血性脑卒中病理生理过程中,ncRNAs在细胞凋亡、氧化应激、小胶质细胞活化、血管新生等多种途径中发挥着重要调控作用[6～9]。

2 机 制

2.1 非编码RNA参与调控脑卒中后细胞凋亡 细胞凋亡是指细胞按自身程序主动死亡的过程,细胞凋亡在形态学和生化特征上表现为细胞皱缩,细胞核、染色质浓缩,DNA片断化,细胞骨架和核蛋白降解,蛋白质交联,凋亡体形成。有研究发现,在急性脑缺血后,大脑有两个重要的独立区域:缺血核心区和缺血半暗区[10]。暴露在血流减少最严重的缺血核心区受到致命的损伤,大量的细胞发生坏死。包围核心区的组织区,因血流减少而失去功能,但仍保持代谢活性,这一区域被称为缺血半暗区,缺血半暗区有许多神经元在数小时或数天后发生凋亡,因此在脑卒中发作后一段时间内有可能恢复,从而减轻脑缺血导致的脑损伤。Radak等[11]也提出脑缺血后迟发性神经元损伤过程中出现细胞凋亡,迟发性神经元损伤主要是由细胞凋亡所致。

细胞凋亡主要有两种途径,即内在途径以及外在途径。内在刺激被线粒体信号通路激活,主要是线粒体细胞色素c(cytochrome C,Cyt-C)或细胞凋亡诱导因子(AIF)的释放。内在途径受到属于Bcl-2家族的一类蛋白质的控制和调节,这些蛋白质可以分为促凋亡蛋白(Bak,Bax等)和抗凋亡蛋白(Bcl-2,Bcl-x等),通过参与调控线粒体膜的通透性调节Cyc-C的释放,进而调控细胞凋亡[12]。外在途径则被TNFR-1(CD120a/p55)、Fas(CD95/Apo1)、DR3、DR4和CD5受体等表面死亡受体激活,通过死亡配体与死亡受体的相互作用,引起细胞凋亡。

大量研究表明miRNA在细胞凋亡中发挥着重要的调节作用。Chang等[13]在大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠模型中发现,过表达miR-195可使大鼠脑梗死的体积和神经元细胞的缺失显著减少。此研究同时发现miRNA-195通过抑制KLF5介导的JNK信号通路的激活,使得Bcl-2的表达增强,而Bax的表达减弱,促进神经元的生长、发育、轴突再生和突触重塑,减弱MCAO大鼠的神经元凋亡。有研究证实JNK信号通路的激活有助于提高Bax的表达并降低Bcl-2的表达,从而诱导神经元细胞凋亡[14]。另外有报道miR-137通过抑制Src基因使MAPK信号通路失活,减少MCAO小鼠脑组织中的细胞凋亡[15]。综上所述,miRNA可以通过调控某些基因介导的JNK、MAPK等信号通路,影响细胞凋亡相关蛋白的表达,从而调控脑神经元细胞的细胞凋亡过程,为脑卒中的防治提供新的靶点。

长链非编码RNA在调控缺血性脑卒中中的细胞凋亡中也发挥着重要的作用。如长链非编码RNA MALAT1可以通过竞争性结合miR-145来影响水通道蛋白4(AQP4)的表达,促进细胞凋亡,从而导致神经元损伤[16]。MALAT1也可作为miR-205-3p的ceRNA,下调miR-205-3p的表达,从而调节肿瘤抑制因子PTEN的表达,抑制缺血性脑卒中中的内皮细胞凋亡,抑制MALAT1则会抑制细胞活力并增加OGD诱导的内皮细胞凋亡[17]。Guo等[18]证实lncRNA MIAT和REDD1在IS大鼠和氧糖剥夺再氧(OGD/R)诱导的PC12细胞损伤中的表达增加。他们发现经si-MIAT干扰后,实验小鼠中的Bax表达降低,而Bcl-2的表达增加,抑制了神经元细胞的凋亡。进一步实验发现MIAT可以通过上调REDD1促进缺血性脑卒中中的神经细胞凋亡,导致脑损伤[18]。有研究报道,过表达长链非编码RNA RIAN可通过Rian/miR-144-3p/GATA3信号通路抑制脑缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡[19]。最近,Wang等[20]发现抑制lncRNA HOTAIR可能通过抗凋亡在缺血性脑卒中发挥保护作用,同时提出lncRNA HOTAIR可能是疾病诊断和预后的潜在生物标志物,但还需进一步的研究证实。综上所述,lncRNA可以通过ceRNA机制竞争性结合miR-145,或直接调控相关基因REDD1、MALAT1的表达和阻断相关信号通路等发挥作用,抑制或促进神经元细胞的凋亡,同时还能做为生物标志物用于脑卒中的诊断和预防。

如上所述,非编码RNAs可以通过调控凋亡相关信号通路和基因的表达,或通过ceRNA机制,影响促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的生成,抑制神经元细胞凋亡,改善缺血性脑卒中的预后,为脑缺血性脑卒中的防治提供新的靶点。非编码RNAs也能促进神经元细胞的凋亡,通过抑制特定的促凋亡ncRNA的调控作用,也能逆转缺血性脑卒中造成的损伤。同时相关ncRNAs还能做为生物标志物,通过检测其血清含量来判断脑卒中的病情,用于脑卒中的诊断和预防。但目前非编码RNA调控的确切机制还需要进一步阐明,作为生物标志物也还不成熟,需进一步的研究。

2.2 非编码RNA参与调控脑卒中后氧化应激 氧化应激(oxidative stress,OS)是指体内强氧化剂的形成与生理抗氧化能力之间的不平衡的一种状态。强氧化剂如超氧化物(O2-)、羟基自由基(OH-)等在炎症反应、细胞凋亡、自噬和血脑屏障(BBB)破坏引起的继发性脑损伤中起着重要作用[21]。在脑缺血再灌注中,由于大量高度有害的活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生,引起氧化应激,从而造成缺血再灌注损伤,导致脑组织损伤[22]。

越来越多的研究表明非编码RNAs在调节氧化剂和抗氧化剂之间的平衡中,在ROS的生成调控中发挥着重要的作用[23]。在MACO小鼠模型中,Tian等[15]研究发现敲除miR-137可以显著增加小鼠的脑梗死体积,同时miR-137的敲除也会增强小鼠脑组织中的氧化应激和炎症反应,使得ROS的浓度和TNF-α、IL-1、IL-6等的表达均升高。进一步研究发现miR-137是通过阻断Src介导的MAPK信号通路来抑制氧化应激。有研究发现miR-221-3P通过下调PIK3R1和抑制TGF-β信号传导激活来抑制MACO小鼠中TNF-α、IL-6、IL-1β和丙二醛(MDA)的生成,增强CAT、锰超氧化物歧化酶(SOD)的活性,限制IS中的炎症和氧化应激。非编码RNAs同时也能够促进氧化应激,有报道lncRNA RMST通过抑制miR-221-3P的表达和激活TGF-β途径来增强IS[24]。综上所述,非编码RNAs可以通过调控MAPK信号通路或TGF-β途径等,抑制炎症因子和活性氧的生成,减轻氧化应激的损伤。

氧化应激在炎症反应、细胞凋亡、自噬和血脑屏障破坏引起的继发性脑损伤中起着重要的作用,通过调控氧化应激损伤从而改善脑损伤显得越发关键。越来越多的研究表明，非编码RNAs对脑缺血相关氧化应激损伤中转录后基因调控很重要,在缺血性脑卒中后氧化应激损伤反应和控制病理事件中起着重要作用,但其在缺血性脑卒中后的氧化应激损伤中的具体调控机制还存在争议,仍有待探索。

2.3 非编码RNA参与调控脑卒中后小胶质细胞的激活 小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的常驻免疫细胞,能够识别源自死亡细胞的多种危险信号、病原体、自身抗原及神经递质,发挥免疫监视和吞噬功能[10]。在缺血性脑卒中后小胶质细胞被激活[25],形成两种不同的表型,即经典激活型M1和替代激活型M2。M1型小胶质细胞主要发挥促进炎症反应的功能,通过促进IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎细胞因子的释放,加剧炎症反应,导致不良后果[26]。Nishioku 等[27]研究发现激活的小胶质细胞释放的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)可以诱导血脑屏障(BBB)功能障碍,增加血脑屏障的通透性,进一步促进神经炎症和脑水肿,导致严重的脑损伤。M2型小胶质细胞通过分泌IL-4、IL-10、精氨酸酶-1(Arg-1)、转化生长因子β(TGF-β)和几丁质酶3样蛋白3(CHI3L3)等抗炎细胞因子和生长因子发挥抗炎功能,促进脑组织细胞的修复和再生,实现对脑的保护作用[26]。大量的研究表明非编码RNAs对小胶质细胞的激活具有调控作用。Lian等[28]研究发现OGD/R组M1小胶质细胞标记物iNOS、CD11b增加,而M2小胶质细胞标记物Arg1和CD206的相关蛋白水平减少,敲除lncRNA NEAT1逆转了这些效应,说明NEAT1可促进OGD/R诱导的小胶质细胞M1型激活,增强炎症因子的表达水平,促进OGD/R引起的炎症反应[28]。实验还发现,miR-374a-5p的下调可以提高CD11b和iNOS的蛋白水平,降低CD206和Arg1的蛋白水平,进一步实验发现NEAT1通过靶向miR-374a-5p/NFAT5轴并抑制其表达,从而影响小胶质细胞的激活[28]。SIRT1是一种烟酰胺腺苷二核苷酸依赖性蛋白去乙酰化酶,可以调节NF-κB的转录活性。Li等[29]在Rice-Vannucci新生儿大鼠模型中,发现miR-210可以通过靶向SIRT1和阻断p65脱乙酰化来激活NF-κB信号通路,从而调节M1型小胶质细胞的活化并增强HIE新生大鼠的神经炎症。Huang等也发现在MCAO大鼠模型中,抑制miR-210可以降低小胶质细胞的活化[6]。Deng等[30]在MCAO/R动物模型和体外OGD/R BV2细胞模型中发现,lncRNA Nespas表达显著增加,而沉默Nespas则会加重大脑中动脉闭塞所致的I/R损伤和细胞凋亡。此外,研究还发现Nespas过表达会显著抑制促炎细胞因子的产生和OGD诱导的NF-κB的激活,抑制M1型小胶质细胞的激活。Ren等[31]以缺氧/复氧(hypoxia/re-oxygenation,H/R)损伤的人脑微血管内皮细胞(HBMVECs)为模型,发现沉默circ-Memo1可以也能抑制NF-κB信号通路的激活,从而抑制M1型小胶质细胞激活,减轻氧化应激和炎症反应。综上所述,非编码RNA可以通过miR-374a-5p/NFAT5轴、NF-κB信号通路等,调控小胶质细胞M1型和M2型的激活,从而在缺血性脑卒中导致的脑损伤发挥不同的作用。

M1型和M2型小胶质细胞对炎症反应有不同的作用,对缺血性脑卒中的预后也不一样。非编码RNAs可以抑制小胶质细胞M1型和促进M2型的激活,抑制神经炎症反应,改善缺血性脑卒中导致的脑损伤,这为临床检测和防治缺血性脑卒中提供了新的思路和方法,但ncRNAs调控小胶质细胞M1型和M2型的激活的具体机制仍不是很清楚,需要不断探索。

2.4 非编码RNA参与调控脑卒中后血管新生 缺血性脑卒中主要由脑血管阻塞引起局灶性脑缺血缺氧,进而导致脑损伤。因此,及时恢复或改善缺血脑区的血流供应对于脑卒中的结局和功能恢复至关重要。缺血性脑卒中后的血管新生,可以促进侧支循环并恢复缺血区域的血液供应,减轻缺血性损伤引起的缺血性坏死并逆转神经损伤。血管内皮生长因子(VEGF)是一种典型的促血管生成因子,在血管新生中起着关键的作用。VEGF可以促进内皮细胞的增殖和迁移,诱导相应的配体和受体在内皮细胞上的表达[32]。内皮细胞参与血管生成,可以增殖形成新血管和迁移以延长血管[32]。

Liang等[33]在大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠和体外缺氧-葡萄糖剥夺脑微血管内皮细胞(BMECs)中发现miRNA-26a的表达显著增加。同时通过实验发现转染miRNA-26a mimic的BMECs增殖明显增强,而转染miRNA-26a inhibitor的BMECs增殖明显抑制,提示miRNA-26a可调控脑梗死后微血管内皮细胞和血管生成。此外,实验还发现过表达miRNA-26a可增强VEGF mRNA的表达,而抑制miRNA-26a可降低VEGF mRNA的表达,提示miRNA-26a可调控VEGF。进一步实验证实miR-26a可通过调控VEGF的表达,从而调控脑梗死后BMECs内皮管腔形成,促进MCAO大鼠的血管生成,改善缺血性脑卒中的预后[33]。有报道称,在MACO大鼠模型中,miR-15a和miR-16-1的表达明显增加,而抑制miR-15a和miR-16-1发现VEGF及其受体血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的蛋白表达明显增加。进一步实验发现选择性缺失miR-15a和miR-16-1可以促进血管重塑和刺激功能性血管的新生,从而增强卒中后血管生成,并增加同侧脑血流量[34]。同时也有实验以OGD/R损伤的小鼠BMEC为实验对象,发现小核仁RNA宿主基因12(SNHG12)可以通过调节VEGF表达来促进缺血性脑卒中后的血管生成[35]。circRNA对缺血性脑卒中后血管生成的调节作用也不容忽视。有报道在OGD/R处理的人脑微血管内皮细胞(HBMEC)模型中,发现环状非编码RNA circ_0006768表达水平下降,而过表达circ_0006768可以通过富集VEZF1来减轻OGD/R诱导的HBMEC损伤[36]。VEZF1可以通过增强内皮细胞的增殖、迁移和血管网络形成来促进血管生成[37]。总之,非编码RNAs是可以通过调控VEGF、VEZF1等促进缺血性脑卒中后的血管生成,恢复或改善缺血区域的血液供应,缓解缺血性坏死,改善脑卒中患者的神经恢复。

综上所述,VEGF、VEZF1等对血管的生成具有促进作用,非编码RANs可以通过调控VEGF、VEZF1等的生成,促进缺血性脑卒中后的血管生成,进而恢复或改善缺血区域的血液供应。这是促进缺血性脑卒中后功能恢复的一种有效的方法,但其中的具体机制尚不是很明确,需要进一步研究。

3 总 结

本文就非编码RNAs在缺血性脑卒中的作用机制进行了简单地总结与概括。阐述了非编码RNAs在细胞凋亡、氧化应激、小胶质细胞的激活和血管保护与再生中的调控机制,为提高缺血性脑卒中的临床防治水平提供一定的理论依据和治疗靶点,同时也可能作为疾病诊断和预后的非侵入性生物标志物。但目前仍然有一些问题没有得到解决,如缺血半暗带中的神经元恢复的具体措施,非编码RNAs调控VEGF、VEZF1和小胶质细胞M1型向M2型转移的具体机制等。现有的将非编码RNAs与缺血性脑卒中联系起来的研究大多是在MCAO啮齿类动物模型和体外OGD/R模型中进行的,如何将研究成果转化临床实践还需要大量的研究探索。