岩黄连总生物碱提取工艺及抗氧化活性研究

李 伶，唐文迪，陈寿涣，宁裕龙，覃江克*

(1.广西师范大学 化学与药学学院，广西 桂林 541004；2.省部共建药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室(广西师范大学)，广西 桂林 541004)

岩黄连CorydalissaxicolaBunting(简称CSB)是罂粟科Papaveraceae紫堇属Cordalis植物石生黄堇的全草，因生于岩石旁，功效类似黄连而得名[1]。岩黄连长于高山峭壁上或石缝中，在我国西南地区分布最多，是典型的喀斯特地带药用植物，其性凉、味苦，具有清热解毒、利湿、止血、止痛等功效[2-3]。研究表明，岩黄连具有保肝、抗肝纤维化、抗菌、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用，临床用于治疗病毒性肝炎等疾病，具有良好疗效[4-9]。一般认为岩黄连中的生物碱类化合物是其药效物质[10]，目前对岩黄连的研究主要集中在岩黄连总生物碱的组织分布，单体化合物的分离、鉴定与药理活性研究上[11-17]。岩黄连总生物碱的提取是其后续分离纯化、活性评价和产品开发的基础，因此优化岩黄连总生物碱的提取工艺具有重要现实意义。

目前，总生物碱的提取方法有酸水提取法、醇类溶剂提取法、亲脂性有机溶剂提取法、超声或微波辅助提取法等[18]。酸水提取法具有腐蚀性和成盐损耗大等缺陷，而其他亲脂性有机溶剂毒性高，超声或微波辅助提取法需要特殊设备不太适合大规模生产。相对其他方法，乙醇提取法具有工艺简单、经济便捷、效率高、溶剂易回收、绿色环保等优点，易为广大生产厂家所接受。目前，对于岩黄连总生物碱的提取工艺鲜有报道[19]，且因提取方式、考察指标、参数设定等的差异，常造成研究结果差异性较大，为了满足生产需求尚需系统考察和进一步完善。

自由基是人体内氧化反应过程中产生的中间代谢产物，对机体具有双重作用，适量的自由基可以在生物体内作为信息和调控分子，是一种具有广泛作用的多功能介质。然而，在特定条件下自由基会异常累积，导致机体发生氧化损伤，进而引发氧化应激性相关疾病，如肝癌、肝损伤、病毒性肝炎、肝纤维化等疾病[20-25]。研究表明，岩黄连总生物碱对以上肝类疾病具有良好的疗效，其良好疗效除了与其细胞毒性、抗炎等药理活性有直接关系外，亦可能与其抗氧化活性密切相关[4-9]，故有必要对岩黄连的抗氧化活性进行考察，以便更好地阐明其作用机理。

鉴于以脱氢卡维丁为代表的总生物碱是岩黄连的主要药效组分[26]，本实验采用乙醇提取法，以脱氢卡维丁的得率为评价指标，采用单因素实验系统考察提取温度、提取时间、乙醇体积分数、料液比和提取次数等因素对得率的影响，并通过L9(34)正交试验确定从岩黄连中提取总生物碱的最优提取工艺条件，结合体外抗氧化实验评价岩黄连总生物碱粗提物的自由基清除能力，旨在为其后续的分离纯化、药理活性及应用开发提供一定实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

岩黄连CorydalissaxicolaBunting于2018年6月购于广西东兰县，由广西师范大学唐绍清教授鉴定为罂粟科紫堇属岩黄连。

脱氢卡维丁对照品(纯度大于98%，批号111667-200401，中国药品生物制品检定所)；脱氢甲卡维丁、巴马汀(实验室自制)；乙醇(分析纯，上海泰坦科技股份有限公司)；甲醇(色谱纯，美国TEDIA公司)；三氟乙酸(TFA)(色谱纯，上海泰坦科技股份有限公司)；碘化铋钾(浙江海川化学品有限公司)；去离子水(实验室自制)；其他试剂均为分析纯。

FW177 粉碎机(上海书培实验设备有限公司)；单列数显恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司)；AL104电子天平(梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司)；TU-1820紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；LC-20A分析型高效液相色谱仪(日本岛津科技公司)；Inertil ODS-3(4.6 mm×250 mm)分析柱(日本岛津科技公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 岩黄连总生物碱含量的测定

1.2.1.1 对照品溶液的配制

精密称取脱氢卡维丁对照品10 mg，加入1%盐酸乙醇溶液溶解，定容至100 mL，作为储备液(0.1 g/L)备用。

1.2.1.2 最大吸收波长的确定

将提取的样品溶液和对照品溶液分别在200～800 nm波长范围扫描，结果在346 nm处有最大吸收。

1.2.1.3 标准曲线的绘制

精密吸取对照品储备液，用1%盐酸乙醇溶液稀释，分别配制成2、4、6、8、10、12 mg/L溶液，以1%盐酸乙醇溶液为空白，在346 nm处测量吸光度，以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。回归方程和相关系数分别为y=0.066 62x-0.002 78，R2=0.999 45。

1.2.1.4 提取样品溶液浓度测定方法

量取样品溶液，根据1.2.1.3方法测定吸光度，通过标准曲线计算提取样品溶液中岩黄连总生物碱的浓度，按式(1)计算得率：

(1)

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 提取温度对岩黄连总生物碱得率的影响

称取5份岩黄连粉末，每份4 g，按料液比1∶10(质量(g)∶体积(mL)，全文同)加入体积分数80%乙醇，分别于50、60、70、80、90 ℃提取2 h，各提取3次，趁热过滤，合并提取液，用移液枪精密吸取50 μL提取液，稀释200倍后测定提取液中岩黄连总生物碱的含量，计算岩黄连总生物碱得率。

1.2.2.2 提取时间对岩黄连总生物碱得率的影响

称取5份岩黄连粉末，每份4 g，按料液比1∶10加入体积分数80%乙醇，于70 ℃分别提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，各提取3次，趁热过滤，合并提取液，用移液枪精密吸取50 μL提取液，稀释200倍后测定提取液中岩黄连总生物碱的含量，计算岩黄连总生物碱得率。

1.2.2.3 乙醇体积分数对岩黄连总生物碱得率的影响

称取5份岩黄连粉末，每份4 g，按料液比1∶10分别加入体积分数60%、70%、80%、90%、95%乙醇，70 ℃提取2 h，各提取3次，趁热过滤，合并提取液，用移液枪精密吸取50 μL提取液，稀释200倍后测定提取液中岩黄连总生物碱的含量，计算岩黄连总生物碱得率。

1.2.2.4 料液比对岩黄连总生物碱得率的影响

称取5份岩黄连粉末，每份4 g，按料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14加入体积分数80%乙醇，70 ℃提取2 h，各提取3次，趁热过滤，合并提取液，用移液枪精密吸取50 μL提取液，稀释200倍后测定提取液中岩黄连总生物碱的含量，计算岩黄连总生物碱得率。

1.2.2.5 提取次数对岩黄连总生物碱得率的影响

称取5份岩黄连粉末，每份4 g，按料液比1∶10加入体积分数80%乙醇，70 ℃提取2 h，各提取1、2、3、4、5次，趁热过滤，合并提取液，用移液枪精密吸取50 μL提取液，稀释200倍后测定提取液中岩黄连总生物碱的含量，计算岩黄连总生物碱得率。

1.2.3 正交试验

在单因素实验的基础上，采用L9(34)正交试验进一步分析提取温度、提取时间、乙醇体积分数及料液比对岩黄连总生物碱提取的影响，优化其乙醇提取工艺条件，所设计的因素水平见表1。

表1 岩黄连总生物碱提取L9(34)正交试验因素水平Tab. 1 L9(34) factors and levels of orthogonal test of extracting of total alkaloids from CSB

1.2.4 提取物的鉴别与分析

取最优工艺下获得的提取物，采用碘化铋钾显色法[27]检验是否含生物碱；以脱氢甲卡维丁、脱氢卡维丁、巴马汀为对照品，采用高效液相色谱法(HPLC)对提取物进行分析。

HPLC色谱条件：检测波长346 nm，流速1 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL，甲醇-0.1% TFA溶液为流动相梯度洗脱(甲醇0～30 min，体积分数10%～100%；30～40 min，体积分数100%)。

1.2.5 抗氧化活性测定

1.2.5.1 待测样品液的制备

将岩黄连总生物碱提取液冷冻干燥，准确称量500 mg，加入1%盐酸溶液溶解，定容至100 mL，作为储备液(5 g/L)备用。用1%盐酸溶液稀释待测样品储备液，分别配制成1、2、3、4、5 g/L的待测样品。

1.2.5.2 DPPH自由基清除率的测定

参照文献[28]方法，分别移取2 mL不同浓度(1～5 g/L)的样品液与2 mL的DPPH(2×10-4mol/L)溶液于试管中，混匀，30 ℃恒温反应30 min，在517 nm处测定其吸光度，同时以Vc为对照品。每个样品重复3次并取其平均值，按式(2)计算清除率：

清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]。

(2)

式中:Ai为加入样品后的吸光度；Aj为样品自身的吸光度；Ac为空白对照液吸光度。

1.2.5.3 ABTS自由基清除率的测定

参照文献[29]方法，准确配制7.6 mmol/L ABTS储备液和2.6 mmol/L高硫酸钾储备液，并将两者等体积混合避光反应12 h，得到ABTS溶液，测定时用无水乙醇将配制好的ABTS溶液稀释至在734 nm处的吸光度值为0.70±0.02。分别移取0.1 mL不同浓度(1～5 g/L)的待测样品液于试管中，加入4.9 mL稀释后的ABTS溶液，混匀，30 ℃恒温反应10 min，在734 nm处测定其吸光度，同时以Vc为对照品。每个样品重复3次并取其平均值，按式(2)计算清除率。

1.2.5.4 羟基自由基清除率的测定

参照文献[30]方法，分别移取1 mL不同浓度(1～5 g/L)的样品溶液于试管中，加入1 mL浓度为9 mmol/L的硫酸亚铁溶液，1 mL浓度为9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，蒸馏水定容至5 mL，再加入 1 mL 6 mmol/L的H2O2溶液启动反应，37 ℃恒温反应10 min，于510 nm波长处测定其吸光度，同时以Vc为对照品。每个样品重复3次并取其平均值，按式(2)计算清除率。

1.2.5.5 超氧阴离子自由基清除率的测定

参照文献[31]方法，在10 mL具塞试管中依次加入4.5 mL浓度为50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH=8.2)，4.2 mL蒸馏水，混匀，25 ℃恒温反应20 min后，立即加入25 ℃预热的3 mmol/L邻苯三酚溶液0.3 mL，迅速混匀，在325 nm处测定吸光度，每隔30 s测定1次，连续测定5 min，计算线性范围内每分钟的吸光度增加值ΔA0。按上述步骤，在试管中加入1 mL不同浓度(1～5 g/L)待测样品溶液，同时减少等体积的蒸馏水，其余操作同上，计算线性范围内每分钟的吸光度增加值ΔAi。以Vc为对照品。每个样品重复3次并取其平均值，按式(3)计算清除率：

清除率=(1-ΔAi/ΔA0)。

(3)

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取温度对岩黄连总生物碱得率的影响

由图1可知，岩黄连总生物碱得率与提取温度呈正相关，当提取温度为60～80 ℃时，岩黄连总生物碱得率随着温度升高呈增长趋势，当提取温度达到80 ℃后，岩黄连总生物碱得率趋于平稳，考虑到生物碱高温下会分解，选择提取温度60、70、80 ℃为考察水平。

图1 提取温度对岩黄连总生物碱得率的影响Fig. 1 Effect of extracting temperature on the yield of total alkaloids from CSB

2.1.2 提取时间对岩黄连总生物碱得率的影响

由图2可知，当提取时间为1.0～1.5 h时，岩黄连总生物碱得率随提取时间增加呈直线上升趋势，提取时间达到1.5 h后，岩黄连总生物碱得率呈现平缓上升趋势，变化不明显。考虑到实际生产效益，选择提取时间2.0、2.5、3.0 h为考察水平。

图2 提取时间对岩黄连总生物碱得率的影响Fig. 2 Effect of extracting time on the yield of total alkaloids from CSB

2.1.3 乙醇体积分数对岩黄连总生物碱得率的影响

由图3可知，乙醇的体积分数在60%～70%时，岩黄连总生物碱得率随乙醇浓度增加呈上升趋势；在乙醇体积分数为70%时，得率达到最高值，当乙醇体积分数超过70%后，岩黄连总生物碱得率呈下降趋势。原因是岩黄连总生物碱具有一定的极性，在一定的极性条件才最适合将其浸出，过高或过低的乙醇体积分数均不利于岩黄连总生物碱的浸出，结合图3我们选择乙醇体积分数60%、70%和80%进行考察。

图3 乙醇体积分数对岩黄连总生物碱得率的影响Fig. 3 Effect of ethanol concentration on the yield of total alkaloids from CSB

2.1.4 料液比对岩黄连总生物碱得率的影响

由图4可知，岩黄连总生物碱得率随料液比的增加整体呈上升趋势，这是因为料液比越大，提取液中生物碱的浓度越低，越有利于生物碱转移到提取液中；但当料液比超过1∶12后，得率开始变化不大，表明生物碱浸出趋于平衡。综合考虑，选择料液比1∶10、1∶12、1∶14为考察水平。

图4 料液比对岩黄连总生物碱得率的影响Fig. 4 Effect of feed liquid ratio on the yield of total alkaloids from CSB

2.1.5 提取次数对岩黄连总生物碱得率的影响

由图5可知，随着提取次数的增加，岩黄连总生物碱的得率增大，当提取3次后再增加提取次数，得率基本不变，为5.36%。原因是达到一定提取次数后，岩黄连总生物碱已完全浸出，再增加提取次数对得率影响不大，且不利于后期的蒸发浓缩。综合考虑，选择提取3次为最佳提取次数。

图5 提取次数对岩黄连总生物碱得率的影响Fig. 5 Effect of extraction times on the yield of total alkaloids from CSB

2.2 正交试验结果

由表2、表3可知，岩黄连总生物碱提取正交试验中，各影响因素均不显著，可直接根据极差分析选择最优水平组合。由表2极差分析可知，各因素对岩黄连总生物碱得率影响由大到小依次为料液比、提取温度、乙醇体积分数、提取时间；乙醇法提取岩黄连总生物碱的最佳工艺条件为A3B2C1D3，即岩黄连总生物碱的最优提取工艺为：提取温度80 ℃、提取时间2.5 h，乙醇体积分数60%，料液比1∶14，提取3次，在此条件下，岩黄连总生物碱的得率为7.34%。

表2 岩黄连总生物碱提取正交试验结果Tab. 2 Results of orthogonal experiment on extraction of total alkaloids from CSB

表3 岩黄连总生物碱提取正交试验方差分析结果Tab. 3 Variance analysis of orthogonal experimental on total alkaloids from CSB

2.3 提取工艺验证实验

精确称取3份岩黄连粉末，每份4.00 g，按照最优工艺进行提取，测定其岩黄连总生物碱的得率，结果见表4。

表4 验证试验结果Tab. 4 Results of verification test

2.4 提取物的鉴别与分析

最优工艺条件下的提取物对碘化铋钾反应呈阳性，表明其含有生物碱类化合物。以岩黄连中含量高的代表性化合物：脱氢甲卡维丁、脱氢卡维丁、巴马汀为对照品，采用HPLC法对该提取物进行分析(表5)，发现这3种生物碱的峰面积占比之和大于75%，表明该提取物的主要成分为生物碱，而且以这3种化合物为主。

表5 HPLC分析结果Tab. 5 Results of HPLC

2.5 抗氧化活性

2.5.1 岩黄连总生物碱粗提物对DPPH自由基的清除作用

以Vc为对照，分析岩黄连总生物碱粗提物对DPPH自由基的清除作用，测定结果如图6所示。由图6可知，在1～5 g/L，岩黄连总生物碱粗提物对DPPH自由基有较好的清除作用，且清除能力具有浓度依赖性。当浓度达到3 g/L时，对DPPH自由基的清除率为95%，再继续增加浓度，其对DPPH自由基的清除能力增长趋于平缓且略优于Vc，IC50为0.675 g/L，说明岩黄连总生物碱粗提物对DPPH自由基有很好的清除能力。

图6 岩黄连总生物碱粗提物对DPPH自由基的清除作用Fig. 6 DPPH· free radical scavenging abilities of crude extract of total alkaloids from CSB

2.5.2 岩黄连总生物碱粗提物对ABTS自由基的清除作用

以Vc为对照，分析岩黄连总生物碱粗提物对ABTS自由基的清除作用，结果如图7。由图7可知，岩黄连总生物碱粗提物对ABTS自由基具有中等程度的清除作用，随着浓度的增加清除能力增强，但是在1～5 g/L，岩黄连总生物碱粗提物整体的清除率在60%左右，IC50为0.78 g/L，清除能力低于Vc。

图7 岩黄连总生物碱粗提物对ABTS自由基的清除作用Fig. 7 ABTS+·free radical scavenging abilities of crude extract of total alkaloids from CSB

2.5.3 岩黄连总生物碱粗提物对羟基自由基的清除作用

以Vc为对照，分析岩黄连总生物碱粗提物对羟基自由基的清除作用，测定结果如图8所示。由图8可知，羟基自由基清除率随着岩黄连总生物碱粗提物质量浓度的增加缓慢上升，表明岩黄连总生物碱粗提物对羟基自由基具有一定的清除能力。

图8 岩黄连总生物碱粗提物对羟基自由基的清除作用Fig. 8 Hydroxyl free radical scavenging abilities of crude extract of total alkaloids from CSB

2.5.4 岩黄连总生物碱粗提物对超氧阴离子自由基的清除作用

图9 岩黄连总生物碱粗提物对超氧阴离子自由基的清除作用Fig. 9 Superoxide anion free radical scavenging abilities of crude extract of total alkaloids from CSB

3 结论

本文采用乙醇提取法提取岩黄连中的总生物碱，在探讨单因素对提取效率影响的基础上，通过正交试验对提取工艺进行优化，并研究其体外抗氧化活性。结果显示，各因素对岩黄连总生物碱的得率影响由大到小依次为料液比、提取温度、乙醇体积分数、提取时间；其最佳提取工艺为：提取温度80 ℃，提取时间2.5 h，乙醇体积分数60%，料液比1∶14，提取3次，得率为7.34%。岩黄连总生物碱粗提物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基有较好的清除作用，对ABTS自由基和羟基自由基有一定程度的清除作用，其中，岩黄连总生物碱对DPPH自由基的清除率最好，IC50值为0.675 g/L。下一步，我们将在岩黄连总生物碱进一步分离纯化的基础上，深入研究其在细胞和动物水平上的抗氧化效应和其他药理活性，以更好阐明其作用机制。

利用乙醇提取岩黄连总生物碱具有工艺简单、经济便捷、效率高、速度快等优点，获得的岩黄连总生物碱粗提物具有良好的抗氧化活性。该研究为其后续的进一步分离纯化、工艺放大和拓宽其利用途径提供了实验依据。