全州禾花鲤色素细胞组成、分布及色素含量观测

武 霞,许艺兰,文露婷,黄 姻,覃俊奇,周康奇,杜雪松,陈 忠,潘贤辉,宾石玉，3*

(1.广西师范大学 生命科学学院，广西 桂林 541006；2.广西壮族自治区水产科学研究院 广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西 南宁 530021；3.珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室，广西 桂林 541006)

全州禾花鲤Cyprinuscarpio又名禾花鱼、禾花乌鲤，隶属鲤形目Cypriniformes鲤科Cyprinidae鲤属Cyprinus(Linnaeus, 1758)，原产于广西全州县[1]，是我国稻鱼共生系统农作模式保存和维系而来的宝贵种质资源。该群体经过长期稻田环境驯化和人工选择，形成了有别于其他养殖鲤鱼群体的独特表型。在体色上，表现为乌褐色，背部颜色稍深，鳃盖、腹部肌肉具有半透明特点，鱼鳃和内脏隐约可见；在体型上，表现为体型较短，腹部较大，头背间呈缓缓上升的弧形，背部稍隆起；在品质方面，鱼骨、肌间刺柔软且硬度小，肉质清甜、无土腥味[2]。广西桂北地区利用全州禾花鲤发展稻渔综合种养，显著提高了稻田的单位产出和综合效益[3]。目前该群体已被广东、湖南、贵州等省引进养殖，发展迅速。鲤是我国大宗淡水养殖鱼类[4]之一，且具有丰富的体色遗传变异类型。全州禾花鲤作为地方性养殖群体，其体色性状特殊，尤其是半透明特征，与我国常见的瓯江彩鲤Cyprinuscarpiovar.color、荷包红鲤CyprinuscarpioRedvar.vuyuanensis、兴国红鲤Cyprinuscarpiovar.singuonensis、锦鲤Cyprinuscarpio等养殖品系之间差异显著，从而体色性状成为区分和鉴别全州禾花鲤的直接依据，具有重要的经济价值。

鱼类体色性状的形成和维持受一系列基因、细胞、生理因素和环境因素的复杂调控[5]，且体色构成与色素合成、皮肤、鳞片所含色素细胞的种类、数量、分布及色素细胞之间的相互作用具有密切联系[6]。鲤的体色性状作为关键经济性状之一受到广泛的关注和研究，随着鲤鱼全基因组的发布[7]和不断更新[8]，近几年利用基因组学手段对不同体色类型的鲤鱼开展了很多研究[9-10]，其体色基因表达模式、特异和差异表达的基因筛选等工作取得重要进展，鲤的体色决定机制研究更加深入[11]。截止目前，尚未见国内外其他养殖鲤鱼群体具有与全州禾花鲤类似体色性状的研究报道，该体色性状可能是另一种独特的鲤鱼体色性状，负载着有别于其他鲤鱼品种的体色决定机制多样性，深入研究可能发现和阐释新的体色调控机制。本文以建鲤Cyprinuscarpiovar. Jian为对照，从外观形态、色素细胞构成、皮肤色素含量等方面探讨全州禾花鲤体色性状特征及其与其他鲤鱼品系的差异，拟为进一步研究全州禾花鲤体色性状决定机制提供资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料、仪器及试剂

1.1.1 试验材料

试验鱼采自广西农业良种海南南繁育种基地保存的全州禾花鲤和建鲤群体，具体规格信息见表1。全州禾花鲤群体为2017年从全州县才湾镇引进的禾花鲤群体，建鲤为2019年从广西安桂水产养殖有限公司引进的商品系。

表1 全州禾花鲤和建鲤采样规格信息Tab. 1 Sampling specification information of rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

1.1.2 主要仪器与试剂

LEICA DM1000 LED光学显微镜、PS40A超声清洗仪(深华泰科学仪器有限公司)；TG-16G台式高速离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)；KZ-II高速组织研磨仪(武汉赛维尔生物科技有限公司)；Infinite M Nano+荧光多模式酶标仪(瑞士帝肯)；Nikon Eclipse E100正置光学显微镜及NIKON DS-U3成像系统(日本尼康)。

三卡因甲磺酸盐(MS-222)购自 Sigma 中国公司，无水乙醇、PBS缓冲液购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 外部形态观察

选取体色体型优良的全州禾花鲤和建鲤，直接观察并记录体表体色情况。

1.2.2 鳞片、鳍条及皮肤色素细胞观察

试验鱼采用MS-222 (100 mg/L)麻醉，酒精棉球擦洗鱼体，用镊子在鱼体背部、腹部区域各取4～5片鳞片，用PBS缓冲液漂洗后置于载玻片上观察并拍照，部分鳞片置于载玻片上，用盖玻片轻压，使虹彩细胞破碎，释放出鸟嘌呤晶体，显微镜观察并拍照；剪取背鳍鳍条置于载玻片上，用光学显微镜观察并拍照；手术刀刀柄刮去鱼体背部、腹部的鳞片，剥离皮肤，切取1 cm×1 cm制成玻片标本进行皮肤色素细胞观察并拍照。

1.2.3 皮肤组织切片与细胞观察

分别选取20、250日龄的禾花鲤和建鲤，在其背部取5 mm×5 mm的皮肤组织块，使用通用性组织固定液固定24 h以上，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后纵切，苏木精-伊红(HE)染色，中性树胶封片，显微镜拍片后，用CaseViever软件查看。

1.2.4 皮肤组织色素含量测定

采用鱼黑色素(Melanin)酶联免疫分析试剂盒测定鱼体皮肤的黑色素含量；采用waters 2695 液相色谱仪+2998光电二级阵列检测器检测叶黄素、玉米黄素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素[12]含量。液相条件：色谱柱为Agilent LC-C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)，二极管阵列检测器，柱温35 ℃，流动相(A：乙腈，B：异丙醇)，流速1.0 mL/min，检测波长450 nm，进样体积10 μL。

类胡萝卜素组分含量计算公式为

式中：X为试样中类胡萝卜素总量，单位mg/kg；c为样品提取液中类胡萝卜素的质量浓度，单位μg/mL；V1为复溶体积、V2为提取总体积、V3为取出提取液氮吹的体积，单位mL；m为实际检测试样质量，单位g。

2 结果与分析

2.1 外部形态观察

比较2种鲤的外部形态发现：全州禾花鲤体型粗短，腹部肥大，背部乌褐色，腹部较白半透明，隐约可见内脏；建鲤体型偏扁长，体色为青灰色，全身反射金属光泽(图1)。局部观察发现：全州禾花鲤头部皮肤整体为乌褐色、鳃盖透明，可清晰看见鳃片；背部皮肤为乌褐色，腹部皮肤半透明，隐约可见内脏；鳍条颜色较浅，色素沉积少。建鲤鳃盖部分不透明，反射出金色的金属光泽；背部皮肤为青灰色，有金属光泽，腹部颜色较于背部稍浅；鳍条颜色较深，色素沉积较多(图2)。

图1 全州禾花鲤和建鲤的外部形态观察Fig. 1 Observation on external morphology of rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

A～D分别为全州禾花鲤的头部、背部皮肤、腹部皮肤和背鳍； E～H分别为建鲤的头部、背部皮肤、腹部皮肤和背鳍图2 全州禾花鲤和建鲤的局部形态观察Fig. 2 Observation on local morphology of rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

2.2 鳞片色素细胞观察

鳞片色素细胞比较表明：全州禾花鲤鳞片黑色素细胞数量多于建鲤，且越靠近鳞片顶区边缘的黑色素细胞体积越大；建鲤鳞片含有大量虹彩细胞，位于黑色素细胞层和黄色素细胞层的下层或间隙之中，分布于整个鳞片顶区，越靠近顶区边缘，虹彩细胞的密度越少(图3)。全州禾花鲤鳞片中黑色素细胞主要有2种形态：一是体积小、树突状分支少且粗壮，靠近鳞焦区域；二是细胞体积大、树突状分支多且细，分布于鳞片顶区边缘区域，黑色素颗粒集中于细胞中心，鳞片无虹彩细胞层。而建鲤鳞片中，黑色素细胞的形态多为放射状，树突状分支较多且粗，黑色素颗粒均匀分布在细胞内，有的黑色素细胞为团块状，颜色分布均匀；鳞片顶区的虹彩细胞中含有大量鸟嘌呤结晶体，呈带状分布，观察物理破碎后的玻片标本，可见棒状或杆状的鸟嘌呤结晶体，晶体反射光线而呈现虹彩色和金属光泽。

A： 全州禾花鲤背部鳞片； B： 全州禾花鲤背部鳞片顶区； C： 展示虹彩细胞； D： 建鲤背部鳞片； E： 建鲤背部鳞片顶区； F： 展示鸟嘌呤结晶体； Ir： 虹彩细胞； G： 鸟嘌呤结晶体图3 全州禾花鲤和建鲤的鳞片色素细胞观察Fig. 3 Observation of pigment cells in scales of rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

2.3 皮肤和鳍条色素细胞观察

全州禾花鲤的背部皮肤、背鳍鳍条和建鲤的背部皮肤、背鳍鳍条及腹部皮肤中，均观察到黑色素细胞、红色素细胞和黄色素细胞，且建鲤的背部和腹部皮肤中均观察到了虹彩细胞，而全州禾花鲤腹部半透明的皮肤处只观察到少量的黄色素细胞和红色素细胞，无黑色素细胞。详见图4。

A～D分别为全州禾花鲤的背部皮肤、背部皮肤放大图、腹部皮肤以及背鳍鳍条； E～H分别为建鲤的背部皮肤、背部皮肤放大图、腹部皮肤以及背鳍鳍条； M：黑色素细胞； X：黄色素细胞； R：红色素细胞；Ir：虹彩细胞图4 全州禾花鲤和建鲤的皮肤与鳍条中色素细胞的比对Fig. 4 Comparison of pigmented cells in skin and fin of rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

全州禾花鲤皮肤中黑色素细胞按树突形态可分为3种类型：一是树突明显、分支少且粗壮；二是树突分支较多；三是细胞呈团块状，分支基本消失。黄色素细胞体积较小、形状不规则、细胞边缘不清，颜色为从中心橘黄色向四周过渡为柠檬黄。红色素细胞体积小、呈颗粒状、细胞边缘不清，颜色为橘红色。

建鲤皮肤黑色素细胞有4种形态，分别是：1)树突分支多，黑色素颗粒都分布在细胞各处。2)树突状分支较细而多，黑色素颗粒集中在胞体中央。3)树突状分支较粗而少，黑色素颗粒也集中在胞体中央。4)细胞呈团块状，分支基本消失。黄色素细胞和红色素细胞的形态与全州禾花鲤皮肤中观察到的一致。在黑、黄、红3种色素细胞层的下层观察到虹彩细胞，呈带状或梭状，呈现蓝色和紫色2种色彩。

2.4 皮肤色素细胞染色观察

2种鲤皮肤显微结构见图5，由图可见20日龄禾花鲤和建鲤的背部皮肤具有明显的颜色分层，包括表皮层、真皮疏松层和真皮致密层。染色的表皮层呈现蓝紫色，除表皮细胞外，分布有大量球形或椭圆形的黏液细胞；真皮疏松层和真皮致密层染色下呈现粉红色，致密层的颜色较疏松层深，其间的胶原纤维排列也更加紧密，呈现波浪形，而疏松层的纤维呈网状交织分布，其结构无明显差异。

250日龄的全州禾花鲤和建鲤背部皮肤切片比较见表2和图6。图6显示，相同部位不同个体的黑色素细胞密度不相同，全州禾花鲤背部的黑色素细胞密度大于建鲤。在全州禾花鲤的皮肤中几乎没有发现虹彩细胞带。分别观察全州禾花鲤背部和腹部的皮肤切片，可以发现不同部位的黑色素细胞密度不相同，背部皮肤的黑色素细胞密度较大，往往形成一条连续的黑色素细胞带，而腹部皮肤的黑色素细胞数量较少。

EL: 表皮层；DL: 真皮疏松层；DD: 真皮致密层；Sc: 鳞片；Mu: 肌肉；MC: 黏液细胞；M: 黑色素细胞图5 20日龄全州禾花鲤和建鲤背部皮肤组织切片显微结构Fig. 5 Microscopical observation on skin section of rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

表2 全州禾花鲤和建鲤皮肤组织染色观察对比Tab. 2 Skin tissue staining of rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

A～C： 全州禾花鲤背部皮肤纵切；D～F： 建鲤背部皮肤纵切；EL: 表皮层；PL: 色素层；DL: 真皮疏松层；DD: 真皮致密层；MC: 黏液细胞；M: 黑色素细胞；Ir: 虹彩细胞图6 全州禾花鲤和建鲤皮肤纵切及HE染色Fig. 6 HE staining and longitudinal section of skin from rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

2.5 皮肤色素含量测定

全州禾花鲤和建鲤皮肤组织中的黑色素、叶黄素、玉米黄素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素含量如表3所示。与建鲤比较，全州禾花鲤皮肤中的黑色素含量为10.10 ng/L，比建鲤高39.70%(P<0.01)；叶黄素含量为1.53 mg/kg，比建鲤低71.29%(P<0.05)。皮肤中玉米黄素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素含量的差异不显著。

表3 全州禾花鲤和建鲤皮肤色素含量测定结果Tab. 3 Determination results of skin pigment content of rice flower carp in Quanzhou and Cyprinus carpio var. Jian

3 讨论

全州禾花鲤在体色上区别于建鲤的显著特征是背部颜色较深(乌褐色)，腹部半透明，隐约可见内脏，该特征是全州禾花鲤在市场上取得价格优势的关键依据。本研究通过与建鲤的比较，发现全州禾花鲤和建鲤的体表均能观察到黑色素细胞、黄色素细胞和红色素细胞。这3种色素细胞种类组成并无差异，较为显著的区别是全州禾花鲤鳞片的边缘区域出现小部分色素颗粒聚集在细胞核附近、中心颜色较深、边缘不清晰的黑色素细胞，可能为乌褐色特征做出了贡献；从色素含量测定结果分析，全州禾花鲤皮肤的黑色素、叶黄素含量显著高于建鲤，而玉米黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素含量并无显著差异，与全州禾花鲤背部颜色较深(乌褐色)的特点吻合；同时，发现上述2种鲤最最显著的区别在于全州禾花鲤体表缺乏可反光的鸟嘌呤结晶体，尤其在鳞片下层细胞和皮肤色素细胞层中表现突出，初步认为这是导致全州禾花鲤体表半透明特征的直接原因。鸟嘌呤结晶是规律排列在虹彩细胞中的一类反光物质，通常呈现金属光泽，在体色决定中扮演重要角色[13-14]。鱼类皮肤和鳞片上的银白色及其他金属光泽颜色是由鸟嘌呤结晶所致[15]。根据前期研究，鸟嘌呤结晶的缺失与鱼体的透明现象相关，在斑马鱼Daniorerio[16]、虹鳉Poeciliareticulate[17]、草金鱼Carassiusauratus[18]、细锯脂鲤Pristellamaxillaris[19]等品种的透明突变体中得到相关验证。虹彩细胞缺失使光线能透过鱼体，显示内部的器官。据此推断，全州禾花鲤的乌褐色特征与其有别于其他品种的黑色素细胞分布特点和较高的黑色素、叶黄素含量有关，而半透明特征是由于鸟嘌呤结晶的缺失所致。

全州禾花鲤在漫长的养殖过程中[20]，经历了稻田环境和人工选择的共同作用[21]，逐渐形成了稳定遗传的特有体色性状，是自然选择、人工选择、基因突变以及环境因子共同作用的结果[22-24]，其乌褐色、半透明特点对其适应稻田环境具有积极意义。首先，乌褐色更接近稻田中泥土的颜色，有利于在稻田浅水环境中躲避捕食者。其次，鸟嘌呤结晶的缺失使其在光线下不显示金属光泽，同样有利于降低被鸟类等捕食者发现的几率。另外，全州禾花鲤的体色和鸟嘌呤结晶缺失特性为研究鲤鱼体色决定机制提供了新的材料和机遇。对上述科学问题的深入揭示，将有助于发现和阐释新的鱼类体色调控机制。从全州禾花鲤种质资源的角度，针对上述性状特点开展遗传解析，挖掘相关功能基因[25]，筛选分子标记[26]，不仅有助于全州禾花鲤种质鉴定和保护利用，具有较大科学价值，更应是全州禾花鲤体色后续相关研究的重点方向。