千金苇茎汤合桃红四物汤对慢性盆腔炎模型大鼠的影响*

宗利平，侯思伟，郝明玲，雷颀，刘方洲，王希浩

1.河南省直属机关第二门诊部，河南 郑州 450004； 2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000；3.河南省中医药研究院附属医院，河南 郑州 450008

慢性盆腔炎(chronic pelvic inflammatory disease，CPID)属于盆腔慢性炎症疾病，通常出现在女性患者群体中，存在于盆腔内生殖器官、四周结缔组织和盆腔腹膜位置，是女性的常见病、多发病，在我国成年女性中的发病率为40%以上，且这一比例在逐年上升[1]。慢性盆腔炎包括子宫炎、输卵管卵巢炎、盆腔结缔组织炎及盆腔腹膜炎[2]，可表现为慢性下腹部、腰背部疼痛或坠胀不适、月经失调、痛经[3-4]，其反复发作给女性生活带来负面影响。本文在千金苇茎汤合桃红四物汤治疗慢性盆腔炎临床疗效的前提下，建立大鼠模型模拟慢性盆腔炎的发病历程，探讨千金苇茎汤合桃红四物汤对模型大鼠子宫细胞间黏附分子-1(intercelluar adhesion molecule-1，ICAM-1)、核转录因子kappa B(nuclear factor of kappa B，NF-κB)及血清中白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的影响，进一步分析中医药治疗在抗炎、调节免疫及抗粘连方面的作用机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 动物及细菌Wistar雌性大鼠100只，体质量为(200±20)g，购自河南省实验动物基地，许可证号：SCXK(豫)2010-0002，该实验经河南省实验动物管委会伦理审批，伦理批号：医动字第0002331号。所有大鼠饲养于通风、光线良好的实验动物房内，温度20～25 ℃，相对湿度40%～60%。溶血性链球菌ATCC44815、致病性大肠菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923全部源自河南省中医院细菌室。

1.2 药物与试剂妇炎康片(广州德鑫制药有限公司，批准文号：国药准字Z44023648，产品批号：111005)；甲硝唑片(亚宝药业集团有限公司，批准文号：国药准字H14020964，产品批号：110119)；阿莫西林胶囊(哈药集团制药总厂，批准文号：国药准字H20044605，产品批号：A120102429)。IL-10、NO、NOS酶免试剂盒(上海劲马生物科技有限公司，货号：JB975-Ra、JB131-Ra、JB132-Ra)；NF-κB、ICAM-1免疫组化试剂盒(北京中杉生物工程公司，货号：HB-T2171、LZ-R3552)；水合氯醛(上海化学试剂制药厂，批号：W20101029)。

1.3 仪器BS224S型电子天平(德国赛多利斯集团)；大容量低速冷冻离心机(上海中科生物医学高科技开发有限公司)；EB-2800M LIBROR型电子天平(日本岛津制作所)；HG3003-3型摊片烤片机 (南京电器三厂)；OLYMPUS光学显微镜(日本奥林巴斯株式会社)；Biosens Digital Imaging System v1.6型分析仪(上海富山科学仪器有限公司)；冰柜(海尔电器有限公司)；DHG-9031电热恒温水浴箱(上海精宏实验设备有限公司)。

2 方法

2.1 药物制备千金苇茎汤合桃红四物汤由薏苡仁、桃仁、冬瓜仁、苇茎、黄芪、当归、生地黄、赤芍、蒲公英、败酱草等多种药物组成，由河南省中医药研究院制剂室提供，并经河南省中医药研究院鉴定合格。将上述饮片浸泡30 min后，武火煮沸，再文火煎煮 30 min，过滤取液；另煎药渣取液，2次滤汁混合，煎煮浓缩之后得到浓度为含生药量1.24 g·mL-1的浸膏，高温消毒后置于4 ℃冰箱保存备用。

2.2 致病菌培养把溶血性链球菌ATCC44815、大肠杆菌ATCC25922与金黄色葡萄球菌ATCC25923按照1：2：1比例全部接种到含营养琼脂的血平板上，35 ℃培养24 h之后，使用2 mL无菌蒸馏水稀释菌液，选取经过24 h培育的菌株，使用标准麦氏管比浊(相当于30亿个菌)得到所需混合菌液4.5×106mL-1，该操作在河南省中医院细菌培养室完成。

2.3 动物分组、造模与给药随机从100只Wistar雌性大鼠中取出22只作为正常组(10只)和假手术组(12只)，剩余78只大鼠进行造模。大鼠禁食禁水24小时后，称量每只大鼠的体质量并记录数据。采用10%水合氯醛3 mL·kg-1腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠加固到操作台上，剃去大鼠腹部被毛，以碘伏消毒，在无菌环境下，于大鼠的下腹部正中给予长约0.8～1.0 cm切口，暴露子宫，使用机械损伤法用 1 mL 无菌注射器对子宫内膜组织进行损伤后朝左侧子宫卵巢灌输0.1 mL菌液[5]；右侧不进行任何操作，正常缝合。假手术组大鼠卵巢内灌输0.1 mL蒸馏水，其他同上。正常组大鼠不做任何处理。术后第5天、第10天、第20天及第30天分别随机选择3只造模大鼠进行观察，当大鼠出现盆腔充血、炎性肿胀，盆腔内有明显纤维组织粘连，子宫充血，甚至宫腔积水，子宫弹性减弱，变硬等炎性改变时视为造模成功。此外，造模大鼠分别在术后第1天、第3天、第9天各死亡2只，假手术组大鼠在术后第1天死亡2只，总计死亡20只。将造模成功的60只大鼠随机分为模型组、千金苇茎汤合桃红四物汤高剂量组、千金苇茎汤合桃红四物汤中剂量组、千金苇茎汤合桃红四物汤低剂量组、妇炎康组及阿莫西林+甲硝唑组，每组10只。千金苇茎汤合桃红四物汤高、中、低剂量组大鼠分别以24.8 g·kg-1、12.4 g·kg-1、6.2 g·kg-1的剂量灌胃给予千金苇茎汤合桃红四物汤溶液，妇炎康组大鼠以0.4 g·kg-1的剂量灌胃给予妇炎康片溶液，阿莫西林+甲硝唑组大鼠灌胃给予0.07 g·kg-1阿莫西林和0.04 g·kg-1甲硝唑混合溶液，正常组、假手术组及模型组大鼠灌胃给予等体积去离子水，灌胃体积均为20 mL·kg-1，每日灌药2次，连续给药30 d。

2.4 检测血清中炎症因子给药结束后，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，无菌条件下暴露腹主动脉，采血5～8 mL，4 ℃、2 000 r·min-1离心15 min，取血清，按照试剂盒说明书操作检测大鼠血清内IL-10、NO、NOS含量。血清标本制作过程中，妇炎康组和假手术组各发生标本溶血1份。

2.5 免疫组化法检测大鼠子宫组织NF-κB、ICAM-1的表达水平无菌环境下将大鼠子宫组织分为2部分，分别置于固定液中备用，免疫组化法检测组织中NF-κB、ICAM-1的表达水平，具体步骤如下：①切片脱蜡至水，PBS冲洗3次，每次 5 min；②柠檬酸抗原修复10 min，等待自然冷却；③PBS浸泡3次，每次5 min；④室温下3%H2O2封闭内源性过氧化物酶20 min；⑤PBS浸泡3次，每次 5 min；⑥滴加山羊血清50 μL/片，封闭内源性生物素，室温下孵育 20 min；⑦甩除山羊血清，勿洗，滴加一抗(兔多隆抗体)50 μL/片，4 ℃条件下孵育过夜；⑧PBS浸泡3次，每次5 min；⑨37 ℃下滴加二抗(抗兔IgG)50 μL/片，孵育30 min；⑩PBS浸泡3次，每次5 min；37 ℃条件下滴加辣根过氧化物酶标记卵霉链白素50 μL/片，孵育30 min；PBS浸泡3次，每次5 min；DAB显色，显微镜下控制染色并用自来水中止；用苏木素复染，梯度酒精脱水；二甲苯透明，应用中性树胶封片，测定NF-κB、ICAM-1水平。

3 结果

3.1 各组大鼠血清IL-10、NO和NOS含量比较与正常组比较，模型组大鼠血清中NO、NOS水平明显升高(P<0.01)，IL-10水平明显降低(P<0.01)。与模型组比较，千金苇茎汤合桃红四物汤中、高剂量组大鼠血清中NO、NOS水平明显降低(P<0.01)，IL-10水平明显升高(P<0.01)；千金苇茎汤合桃红四物汤低剂量组大鼠血清中NO水平明显降低(P<0.05)，IL-10水平明显升高(P<0.05)。与妇炎康组、阿莫西林+甲硝唑组比较，千金苇茎汤合桃红四物汤高剂量组大鼠血清中NO、NOS水平明显降低(P<0.05)，千金苇茎汤合桃红四物汤高、中剂量组大鼠血清中IL-10含量明显升高(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠血清IL-10、NO和NOS含量比较

3.2 各组大鼠子宫组织NF-κB蛋白表达水平比较与正常组比较，模型组大鼠子宫组织中NF-κB蛋白表达水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，千金苇茎汤合桃红四物汤各剂量组大鼠子宫组织中NF-κB蛋白表达水平明显降低(P<0.01)；与妇炎康组、阿莫西林+甲硝唑组比较，千金苇茎汤合桃红四物汤高、中剂量组大鼠子宫组织中NF-κB蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。见表2，图1。

注：A：正常组；B：假手术组；C：模型组；D：千金苇茎汤合桃红四物汤高剂量组；E：千金苇茎汤合桃红四物汤中剂量组；F：千金苇茎汤合桃红四物汤低剂量组；G：妇炎康组；H：阿莫西林+甲硝唑组图1 各组大鼠子宫组织NF-κB免疫组化检测图(×200)

3.3 各组大鼠子宫组织中ICAM-1蛋白表达水平比较与正常组比较，模型组大鼠子宫组织中ICAM-1蛋白表达水平明显升高(P<0.01)；与模型组比较，千金苇茎汤合桃红四物汤各组大鼠子宫组织ICAM-1蛋白表达明显降低(P<0.01)。见表2，图2。

表2 各组大鼠子宫组织中NF-κB、ICAM-1蛋白表达水平比较

注：A：正常组；B：模型组；C：假手术组；D：千金苇茎汤合桃红四物汤高剂量组；E：千金苇茎汤合桃红四物汤中剂量组；F：千金苇茎汤合桃红四物汤低剂量组；G：妇炎康组；H：阿莫西林+甲硝唑组图2 各组大鼠子宫组织中ICAM-1免疫组化检测图(×200)

4 讨论

慢性盆腔炎为源自盆腔的急性炎症，也是促炎、抗炎因子失衡与身体免疫调节导致的结果[6]，主要症状是结缔组织的增生粘连导致输卵管轻度充血、肿胀等，进一步与四周组织粘连，可引起不孕不育、异位妊娠以及盆腔疼痛等负面问题[7]，严重影响妇女的生殖健康[8]。目前，临床多采用抗生素进行治疗，但抗生素对慢性盆腔炎所产生的粘连、疼痛和血液循环障碍等的效果并不理想[9]。近年来的研究发现，中医药治疗慢性盆腔炎具有独特的优势，疗效良好[10-11]。

中医学无慢性盆腔炎这一病名，而是依据临床症状将其划分到“妇人腹痛、不孕症、带下病”的范畴[12]，认为该病多由行经后或产后胞门虚弱开阖，风、寒、湿、热、毒等之邪气乘虚内侵下焦，与冲任搏结留滞而瘀[13]，其致病机理主要包括湿热、气滞、血瘀等[14]。湿热瘀虚彼此为对方的因果，相互交织为病，造成盆腔粘连、增生以及炎性包块，这也是不可忽视的病理机制。基于此，本研究团队提出健脾益气利湿、活血解毒消痈的治疗理念。千金苇茎汤合桃红四物汤中薏苡仁、桃仁健脾除湿、活血祛瘀、解毒消痈，共为君药；臣药冬瓜仁、苇茎、生地黄助薏苡仁解毒消痈排脓之功；佐用黄芪扶助正气、以利活血化瘀、消痈排毒之功；全方合用以凑健脾益气利湿、活血解毒消痈之功效。

千金苇茎汤合桃红四物汤解毒逐瘀排脓效果极佳，现代药理研究表明，苇茎具有较强的解毒消炎作用[15]。桃仁提取物可显著减少纤维肝内的纤维间隔，有利于肝组织修复[16]。赤芍总苷下调Bcl-2、c-myc基因表达并诱导肿瘤细胞凋亡[17]。蒲公英具有抗菌[18]、抗氧化[19]、抑制肿瘤[20]等多种药理学作用。NF-κB在炎症反应中起着关键性的作用，其在炎症部位高度表达，研究表明，NF-κB作为一种存在于多种细胞中的基因转录调控蛋白，能够接受外界信息而快速活化，启动炎性因子促进相应蛋白质合成，从而在炎症反应中起重要的调控作用。NF-κB在受到创伤、感染、休克时被激活，并不断激活下游的细胞因子(NO、NOS、TNF-α、TNF-β、ICAM-1、IL-2、IL-6、IL-8 IL-10等)[21]，使各类炎性介质产生过多，从而引起一系列炎症反应。千金苇茎汤合桃红四物汤可明显降低大鼠子宫组织中NF-κB水平，抑制炎症发展；还可抑制NO、NOS的合成，减少其产生的细胞毒性。ICAM-1在慢性炎症中可诱导组织损伤及局部组织慢性纤维化过程[22]，慢性盆腔炎组织中ICAM-1表达增加，证明ICAM-1参与了慢性炎症及纤维化过程[23]，千金苇茎汤合桃红四物汤通过降低子宫组织中ICAM-1的表达水平，明显减轻局部组织损伤，改善局部组织增生、纤维化，降低慢性盆腔炎引起的组织粘连，盆腔包块，这与杨堃[24]的研究结果相似。千金苇茎汤合桃红四物汤可升高慢性盆腔炎大鼠血清IL-10水平，而 IL-10作为一种内源性的抑炎因子，在炎症负反馈调节中起关键性作用，具有减轻炎症细胞过度活化，抑制炎症发展的作用[25]。机体在外来刺激作用下促炎因子(NF-κB、ICAM-1、IL-2等)被激活的同时，IL-10也被激活，抑制促炎因子的产生。IL-10通过调控NF-κB通路减轻炎症细胞过度活化，抑制炎症发展[26]，提示千金苇茎汤合桃红四物汤的治疗机制一方面是抑制炎症因子 NF-κB 及其下游炎症介质NO和NOS的水平，遏制组织纤维化；另一方面又通过提高IL-10水平，增强自身免疫力。

综上所述，千金苇茎汤合桃红四物汤可改善盆腔血液循环，抑制体内炎性反应及纤维组织增生，提高机体免疫应答，改善慢性盆腔炎。