黄毅文 王圆圆 刘晓玢 欧阳樱君
(广州市第一人民医院 华南理工大学附属第二医院 1急诊科,广东 广州 510000;2神经内科)
癫痫是常见的一类神经系统疾病,是由于脑神经元异常和过度超同步化放电造成的大脑功能暂时性障碍,可造成大脑缺氧,长期反复癫痫发作给患者感觉、认知动能和记忆功能造成严重影响,这在老年癫痫患者中尤为明显〔1〕。我国是癫痫发生率较高的国家之一,据统计我国现有癫痫患者约900万,人群总发病率高达7‰〔2〕。目前的研究结果均支持癫痫持续发作与神经元异常放电、血脑屏障破坏、炎症反应等因素造成神经元损伤和凋亡有关〔3,4〕。甘草酸是从甘草中提取的一种三萜皂苷类物质,研究表明甘草酸具有良好的抗病毒、免疫调节、神经元保护作用〔5,6〕。本研究探讨了甘草酸对癫痫老年大鼠神经元的保护作用及可能机制。
1.1实验动物 清洁级健康SD大鼠36只,24月龄,均为雄性,体重335~387 g,平均(365.36±10.28)g,大鼠均自由饮食、饮水,饲养环境温度21~25℃,昼夜各12 h。大鼠均从上海斯莱克实验动物有限责任公司购买〔SCXK(沪)2012-0002〕。
1.2仪器、试剂 甘草酸、苯甲基磺酰氟、BCA法蛋白定量试剂盒、5×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液、细胞裂解液、细胞膜电位检测试剂盒、原位末端转移酶标记法(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3和caspase-9活性检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术研究所。大鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体、抗大鼠高迁移率族蛋白(HMGB)-1单克隆抗体均购自美国CST公司。BX53型荧光显微镜购自美国Olympus公司,电泳仪、蛋白杂交仪和凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad公司。
1.3研究方法
1.3.1模型建立 在大鼠清醒状态下给予腹腔注射127 mg/kg氯化锂溶液,18~22 h后给予腹腔注射10 mg/kg溴化甲基阿托品,30 min后给予腹腔注射30 mg/kg匹罗卡品。观察大鼠行为表现并进行Racine分级,反复Racine分级评价为Ⅳ级以上视为癫痫持续发作。若持续1 h以上则视为造模成功。若大鼠在注射匹罗卡品后30 min未出现癫痫发作,则每间隔10 min追加腹腔注射10 mg/kg匹罗卡品直至造模成功。一旦成功造模,立即腹腔注射10 mg/kg地西泮终止癫痫发作,若注射后15 min仍未能终止则追加腹腔注射10 mg/kg地西泮。
1.3.2分组给药 36只大鼠采用随机数字表法分为正常对照组、模型组和甘草酸组,各12只。模型组和甘草酸组大鼠采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射制作大鼠癫痫模型〔7〕,正常对照组大鼠不进行处理。造模成功后给予甘草酸组大鼠30 mg/kg甘草酸灌胃,给予模型组和正常对照组大鼠等容量生理盐水灌胃。3组大鼠均予连续灌药7 d。大鼠经麻醉后断头处死,立即取出脑组织,在4℃无菌环境下钝性分离法术双侧海马组织,保存于液氮中待测。
1.3.3细胞凋亡检测 将海马组织切片依次置入二甲苯,100%、95%、90%、80%、70%酒精中5 min,经蛋白酶K消化处理60 min后采用pH7.0 磷酸盐缓冲液漂洗3次,采用TUNEL法检测神经元细胞凋亡情况,经TUNEL染色后棕黄色或棕褐色为凋亡细胞,于200倍下计数凋亡细胞数量,计算视野内凋亡细胞所占比例。
1.3.4神经元线粒体膜电位 采用JC-1荧光染色-流式细胞仪检测线粒体跨膜电位(Δψm),具体操作如下:取500 μl海马单细胞悬液加入JC-1荧光染料并使其终浓度为0.5 μmol/L,4℃避光放置10 min后采用流式细胞仪检测Δψm。记录荧光读数值,每个样本计数104个细胞,采用CellQuest软件处理。
1.3.5caspase-3和caspase-9活性检测 取海马组织匀浆处理后加入细胞裂解液2 h,4 500 r/min离心30 min后收集上清液,采用caspase-3和caspase-9活性比色法检测试剂盒测定海马组织中caspase-3和caspase-9活性。
1.3.6Western印迹检测 采用Western印迹方法检测海马组织中HMGB-1表达情况。取1.3.5中的上清液测定总蛋白含量。将50 μg蛋白加入缓冲液并采用煮沸法变性。通过10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h后加入1∶500抗大鼠HMGB-1单克隆抗体于4℃条件下过夜,TBST洗膜30 min,1∶1 000二抗孵育2 h后采用免疫印迹法检测,在凝胶成像系统中曝光。以GADPH作为参比计算相对光密度。
1.4统计学方法 采用SPSS25.0统计学软件进行单因素方差分析。
2.13组海马组织神经元细胞凋亡比例比较 与正常对照组比较,甘草酸组和模型组海马组织神经元细胞凋亡比例明显增加(P<0.01);与模型组比较,甘草酸组海马组织神经元细胞凋亡比例明显降低(P<0.01)。见表1。
2.23组海马组织神经元Δψm比较 与正常对照组比较,甘草酸组和模型组大鼠海马组织神经元Δψm明显降低(P<0.01);与模型组比较,甘草酸组大鼠海马组织神经元Δψm明显增加(P<0.01)。见表1。
2.33组海马组织caspase-3和caspase-9活性比较 与正常对照组比较,甘草酸组和模型组大鼠海马组织caspase-3和caspase-9活性明显提高(P<0.01);与模型组比较,甘草酸组大鼠海马组织caspase-3和caspase-9活性明显降低(P<0.01)。见表1。
2.43组海马组织中HMGB-1表达情况 甘草酸组和模型组海马组织HMGB-1表达水平明显高于正常对照组(P<0.01),甘草酸组海马组织HMGB-1表达水平明显低于模型组(P<0.01)。见表1、图1。
表1 3组海马组织神经元细胞凋亡、神经元Δψm、比较
图1 3组海马组织中HMGB-1表达Western印迹
我国每年新增癫痫发病为(22.39~22.8)/10万,该病已经成为仅次于脑血管疾病的第二大神经系统疾病〔8〕。目前尚未完全清楚癫痫发病机制,但脑电图检查可见多数发作患者存在脑部神经异常放电现象〔9〕。氯化锂-匹罗卡品腹腔注射建立的癫痫动物模型与人癫痫表现、机制高度相似,均可见明显的神经元细胞损伤、凋亡及胶质细胞激活和增生的病理改变,因此常被用于癫痫发病机制、药物研发等研究。本研究即采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射建立癫痫老年大鼠模型,经反复Racine分级观察确定建模成功。
本研究可见癫痫大鼠存在明显的神经元凋亡现象,这也是造成癫痫患者神经功能、认知功能等降低的直接原因。本研究结果提示,通过甘草酸治疗能够抑制神经元凋亡。既往研究发现,癫痫能够造成神经元线粒体功能障碍,表现为Δφm降低、膜通透性增加,线粒体出现死亡而无法维持细胞正常的能量代谢,进而造成细胞凋亡〔10,11〕。本研究结果提示,甘草酸可能通过阻断线粒体电位异常抑制神经元凋亡。
研究证实,caspase在细胞凋亡中发挥重要作用,激活caspase能够造成细胞质、细胞核和细胞骨架中的蛋白质及DNA降解,进而引起细胞凋亡,而有学者认为细胞凋亡实际上是caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程,caspase-3和caspase-9是其中最受关注的2个蛋白〔12,13〕。其中,caspase-3是caspase级联瀑布下游最为重要的1个凋亡蛋白酶,对不同因素启动的凋亡程序中发挥枢纽作用,目前已知有3条细胞凋亡通路在caspase-3处交汇,通过激活下游第五引起肌动蛋白、角蛋白等降解,进而破坏细胞骨架,引起内环境稳态失衡。caspase-9则位于凋亡级联放大反应过程上游,是最重要的凋亡起始因子。卢峰等〔14〕研究发现颞叶内侧癫痫患者海马区CA1区caspase-3、caspase-9蛋白呈高表达,明显高于正常人群,且与患者癫痫发作频率呈正相关。本研究结果说明,甘草酸能够降低caspase-3和caspase-9蛋白水平,进而发挥抑制神经元细胞凋亡。
癫痫发作后人或动物血脑屏障完整性被破坏,激发出现脑水肿、胶质细胞增生、神经元凋亡等脑损伤事件,这又进一步造成癫痫病情加重〔15〕。炎性因子在癫痫发作及脑损伤中具有重要作用,且已经在癫痫发作后血脑屏障破坏患者中检测到白细胞介素(IL)-1b、干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎性因子水平升高。Vezzani等〔16〕研究发现脑部炎性因子能够影响神经元突触信号,减少异质性冲动传输,降低血脑屏障通透性,造成癫痫易感和发作。HMGB-1是一种促炎症因子,通过抑制其活性能够缓解因其释放造成的级联炎症反应,并减轻血脑屏障破坏程度和脑损伤程度,这在脑出血、脑外伤所致血脑屏障破坏和脑损伤中易被证实〔17,18〕。Kim等〔19〕研究结果表明,甘草酸能够特异性选择抑制HMGB-1,本研究结果也证实了甘草酸能够抑制HMGB-1表达。
综上,甘草酸可通过阻断线粒体异常电位保护线粒体功能,降低caspase-3和caspase-9活性抑制凋亡级联放大反应,抑制HMGB-1蛋白表达减轻炎性反应和改善血脑屏障来发挥保护癫痫老年大鼠海马组织神经元的作用。