脑梗死模型大鼠血清中GAP-43、TNF-α和血管形成素-1表达水平

方建伟 李爱芹

(承德市中心医院神经内科，河北 承德 067000)

近年来脑梗死发病率和致残率持续升高，严重影响了患者的生活质量，给患者家庭带来沉重负担，也给社会带来很大压力〔1,2〕。脑梗死不仅会使大脑细胞死亡，更会破坏血脑屏障，使其失去阻挡多种物质进入脑部组织的作用，使脑脊液的物质成分和比例失衡，引起其他疾病〔3,4〕。生长相关蛋白(GAP)-43与神经细胞再生和突触发育关系密切。肿瘤坏死因子(TNF)-α是一种对正常细胞无明显毒副作用，却可以杀死非正常细胞的因子，还可促进细胞增殖分化，增强有丝分裂原或外来抗原刺激B细胞的增殖和Ig分泌〔5〕。血管形成素(Ang)-1是神经细胞损伤后间质血管新生的蛋白质，可促进间质的肉芽组织的形成，还可改善局部血液循环，保护神经细胞的正常功能〔6〕。本文探讨脑梗死大鼠血清中GAP-43、TNF-α和Ang-1的表达水平的变化及其神经功能的变化。

1 材料与方法

1.1材料 研究动物：选择SD健康雄性大鼠40只，由广西医科大学实验动物中心提供。其年龄10～11周龄，平均(10.3±0.5)周龄，体重220～250 g,平均(236.6±12.4)g，饲养温度为22～25℃，室内湿度35%～40%，饲养室定时予紫外线消毒。并饲喂统一标准饲料，自由活动。选取15只作为对照组，不做任何处理。剩下的20只做成脑梗死模型，为脑梗死模型组。另外养5只大鼠备用，避免实验动物因实验过程中出现死亡及其他因素导致的动物死亡，进而保证数据的完整性。本研究所做实验均获得医院伦理会批准。

1.2模型制备 将除去对照组的15只大鼠禁食不禁水饲养12 h，然后给予10%的水合氯醛麻醉，用线栓法将麻醉的大鼠制作大鼠脑梗死动物模型。把大鼠仰卧固定在实验台上，充分暴露其颈部皮肤，用75%的酒精消毒后，打开大鼠颈部皮肤，利用分离针分离出颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，在远心端结扎颈外动脉，然后在颈内动脉远心端和颈总动脉近心端，用动脉夹阻断循环血流。将颈外动脉在结扎处剪断，从剪断处插入栓线，直至颈内动脉处，然后打开颈内动脉夹，继续推进栓线，直到遇到阻力，当阻断大脑中动脉血流后，继续将栓线深插入18～20 mm，最后固定栓线并缝合皮肤。2 h后再次用10%的水合氯醛麻醉大鼠，把栓线拔出来，缝合伤口，75%酒精消毒。模型制备完成后，给予大鼠抗感染护理，让其自由摄食和饮水。大鼠苏醒后，左侧表现为Horner征，提尾时右侧前肢内收屈曲,右前爪不能伸展或存在右侧转圈障碍，则建模成功。手术过程中，死亡2只，感染1只，另外还有1只建模失败，其神经病理症状不明显，予以剔除。备用大鼠补上，以保证数据的完整性。

1.3酶联免疫吸附试验检测大鼠血清中GAP-43的水平 抽取各组大鼠清晨空腹静脉血3 ml，使用离心机离心处理10 min，转速为3 000 r/min，分离出血清和红细胞；加入乙二胺四乙酸(EDTA)和肝素，3 000 r/min离心10 min,取上清液；再3 000 r/min离心10 min，取组织匀浆，加入生理盐水中，捣碎，3 000 r/min离心10 min,取上清液。于-20℃冰箱中保存,待检。运用酶联免疫法测定血清GAP-43的水平。在测定时，严格按照GAP-43试剂盒说明书进行操作，把待测样本加入GAP-43试剂盒中，血清中受检测物质与固相载体上的酶量充分结合，并成一定的比例，用洗涤的方法除去杂质，加入微孔板酶标仪中，其形成的复合物中加入酶反应的底物，最后形成有色产物，通过比色检测血清中GAP-43的量，进行接下来的指标水平比较。

1.4电化学发光免疫分析法检测血清TNF-α、Ang-1的水平 严格按照化学发光免疫分析仪操作步骤进行操作。采用i2000全自动微粒子化学发光免疫分析仪及其配套试剂进行检测。将鲁米诺发光底液加入待测样本中，与辣根过氧化物酶(HRP)反应后，形成中间体，处于激发状态的中间体稳定后，会发射光子。然后使用发光信号测量仪测量光子数值，检测TNF-α、Ang-1的水平。

1.5RT-PCR技术检测GAP-43、TNF-α、Ang-1 mRNA表达水平 操作过程严格按照定量PCR仪的操作说明书进行。首先加入稀释10倍的PCR缓冲液2.5 μl，然后加入MgCl2溶液1.5 μl，之后加入上游引物和下游引物各0.5 μl，混匀后加入水至25 μl。分别放在94℃、55℃和72℃的环境中各反应1 min，此循环连续进行35次，最后在72℃环境中反应延长5 min，重复3次以上。采用2-△△Ct方法计算出需要检测GAP-43、TNF-α、Ang-1 mRNA的表达水平。

1.6大鼠改良神经功能缺损评分(mNSS) 参照刘双凤等〔7〕对大鼠神经功能mNSS的方法，检测对照组大鼠、脑梗死大鼠造模后1 d、3 d、7 d的神经功能，包括提尾试验3分，将老鼠放于地板行走试验3分，感觉试验2分、平衡木试验6分，反射活动和异常运动试验4分，5个方面的神经功能mNSS，评分满分为18分。得分越高其神经功能损伤越严重。

1.7苏木素-伊红(HE)染色测定脑梗死体积 造模成功后对各组大鼠进行10%水合氯醛腹腔麻醉，对大鼠右心室进行快速灌注磷酸盐缓冲液(PBS)，随即断头取脑，在4%多聚甲醛中固定48 h之后放于模具之中，并沿冠状进行切片，向前囟方向切片2张，向小脑方向切片3张，切片保证每片厚约2 mm，并做石蜡包埋处理。对所取大鼠脑组织切片做HE染色，并使用数码相机进行拍摄，利用Image-PmPlus6.0图像分析系统对大鼠脑梗死体积比例进行计算。大鼠脑梗死体积=(正常侧大脑半球体积-梗死侧非梗死区大脑半球的体积)/正常侧大脑半球体积。

1.8统计学处理 采用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1两组GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA表达比较 对照组GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA水平在各时间段无统计学意义(P>0.05)。大鼠造模后，其脑梗死1 d、7 d、14 d时GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA表达水平均明显高于对照组(P<0.05)；脑梗死7 d时大鼠GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA表达水平明显高于脑梗死1 d时，脑梗死1 d时GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA表达水平明显高于脑梗死14 d时(均P<0.05)。见表1。

表1 两组GAP-43、TNF-α、Ang-1水平及mRNA表达比较

2.2两组mNSS及脑梗死体积比较 对照组mNSS及脑梗死体积在各时间段无统计学意义(P>0.05)。脑梗死1、7、14 d的大鼠mNSS均明显高于对照组(P<0.05)；且脑梗死1 d大鼠mNSS明显高于脑梗死7 d大鼠，脑梗死7 d大鼠mNSS明显高于脑梗死14 d大鼠(P<0.05)；脑梗死1、7 d的大鼠脑梗死体积均明显高于脑梗死14 d大鼠(P<0.05)。见表2。

表2 两组mNSS及脑梗死体积比较

3 讨 论

脑梗死治疗后高复发率、高死亡率及高致残率，极大影响了患者的生活质量〔8〕。有资料显示，脑梗死的发病率有明显上升并呈现年轻化的趋势。所以，加深对脑梗死的研究可以为脑梗死的临床判断和治疗提供重要的参考价值，也可为疾病的治疗提供新的思路和方法〔9～11〕。正常情况下，脑毛细血管与脑细胞之间存在血脑屏障，血脑屏障可以有效阻止有害物质进入脑组织，进而避免脑组织损伤，或降低有害物质的侵害。依靠这种方式，维持了脑组织内环境的稳态，这对于生物的生存有着重要的意义〔12,13〕。然而，当脑梗死后发生，血清中炎症介质明显升高，氧自由基及蛋白水解酶等大量增加，会对微血管内皮细胞进行破坏，进而导致血脑屏障通透性增加，有害物质会随着血液循环进入脑组织，这样对脑组织造成严重损伤，尤其是在脑神经元再生过程中，呈现出物质表达水平及交换速度加快情况，脑组织内环境稳态被破坏。

GAP-43具有调解轴突延伸的作用，改变细胞形态，同时其作为细胞内信号，可有效增强与G蛋白偶联受体之间的关联性〔14〕。正常情况下，GAP-43的表达水平很低，血清中的水平也很少，但是当脑梗死发生时，脑组织损伤部位周围神经元的传入侧支发芽，反应性轴突再生，形成负反馈机制，此时，GAP-43的表达水平升高，但也不会一直升高，会随着修复时间的延长而逐渐下降。由于血脑屏障被破坏，血清中的GAP-43水平也会随之发生不同的变化〔15,16〕。因此，检测血清中GAP-43的水平可以作为研究神经生长发育和损伤修复等神经可塑性的方法之一。本研究表明，大鼠脑梗死发生后，其血清中的GAP-43和TNF-α mRNA表达水平迅速升高，当达到最大值后，又开始回落，大鼠的神经功能也有所改善。这可能是由于大鼠脑组织受到损伤后，迅速表达出大量的GAP-43，随着损伤修复速度的增加，GAP-43的表达持续增多，当修复到一定程度时，损伤部位周围神经元的传入侧支和反应性轴突增多，神经末梢的表面积也随之增加，随着新突触的形成，更多的树突和轴突之间建立联系，此时，损伤部位周围神经元的传入侧支发芽和反应性轴突再生减少或者停止，GAP-43的表达水平也随之下降。

TNF-α具有促进细胞增殖和分化等作用〔17〕。TNF-α通过刺激B细胞增殖，促进Ig分泌，也可通过促进与细胞增殖相关的一些原癌基因的表达，刺激细胞周期由G0期向G1期转化〔18〕。本研究显示，大鼠脑梗死发生后，其血清中TNF-α和TNF-α mRNA的表达迅速增多。这可能是由于大鼠脑部神经元受到损伤后，失去其正常功能，为了维持脑组织的功能，需要周围神经细胞代偿性再生，TNF-α和TNF-α mRNA大量表达，以促进周围神经细胞从细胞周期的Go期向G1期转变，促进细胞的分裂增殖，以形成新的突触。当损伤修复到机体所能达到的最大程度时，就逐渐减慢或停止修复，TNF-α的表达也随之回降。

ANG-1是血管内皮细胞的特异性受体酪氨酸激酶-2的配体，为血管生成的主要物质之一，对维持新生血管的稳定性具有重要作用，且可影响血管重构和血管的成熟〔19〕。可见，ANG-1在调节血管功能方面发挥着重要作用。本研究表明，大鼠脑梗死发生后，其血清中ANG-1和ANG-1 mRNA的表达迅速增多。这可能是由于大鼠脑梗死发生后，血脑屏障受到破坏，血清中各种因子的正常平衡打破，血管的完整性不能维持，血清中ANG-1和ANG-1 mRNA的表达增多，以发挥其重构血管的作用，并维持修复后血管的完整性。当血管修复到机体所能修复的最大程度时，血管的重构减弱或停止，ANG-1的表达也降低。

综上，检测脑梗死大鼠血清中GAP-43、TNF-α和Ang-1的表达水平，可以更好地判断模型大鼠的脑部神经损伤的严重程度，为脑梗死的临床判断、以后的治疗以及预后恢复情况提供重要的参考价值。