白花丹素对糖尿病大鼠肾脏氧化应激及脂质代谢的保护作用

李伟华 任维华 杨丽 刘艳萍

(济南市人民医院药剂科，山东 济南 271199)

糖尿病肾病(DN)最主要的特征是糖尿病肾小球细胞的硬化。糖尿病患者的生命健康直接受到糖尿病肾病的严重威胁。白花丹素是药用植物西兰花的主要活性成分。研究表明白花丹素具有多种生物学作用，如抗炎、抗血管生成、抗癌和抗氧化活性。本研究采用腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)的方法制备大鼠糖尿病模型，采用白花丹素治疗，通过检测氧化应激和脂质代谢相关指标，明确其对糖尿病大鼠氧化应激和脂质代谢的作用疗效。

1 材料和方法

1.1实验材料 Wistar雄性大鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)；链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)；白花丹素(上海诗丹德生物技术有限公司)；血糖仪(美国雅培)；石蜡切片机(德国徕卡)；自动脱水机(德国徕卡)；AU2700全自动生化分析仪(日本Olympus公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；兔抗鼠活化的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved capase)-3单克隆抗体、兔抗鼠B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)单克隆抗体、兔抗鼠Bcl-2单克隆抗体、对二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2实验方法

1.2.1模型制备 20只8周龄Wistar雄性大鼠，体重170～200 g，适应性喂养1 w。禁食24 h后，按60 mg/kg腹腔注射STZ，STZ浓度为1%，溶解于pH 4.0新鲜配制的柠檬酸-二水合柠檬酸纳缓冲液中。24 h后，通过大鼠尾静脉取血测定血糖，凡血糖值>250 mg/dl，即纳入实验。

1.2.2实验分组 30只大鼠随机分为正常对照(Con)组，模型(DM)组和模型+白花丹素(DM+PB)组，每组10只，糖尿病模型成模8 w末，分组进行腹腔内给药，Con组和DM组给予生理盐水2 mg/kg，DM组+PB组给予百花丹素溶液2 mg/kg。给药4 w后，测量各组大鼠血糖后处死。

1.2.3肾脏苏木素-伊红(HE)染色 取大鼠肾脏少量剪成小块，经切片染色后进行形态学观察。

1.2.4脂质代谢相关指标检测 血浆总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、游离脂肪酸(FFA)和肾脏TC采用日本奥林巴斯 AU2700全自动生化分析仪测定。

1.2.5氧化应激相关指标检测 右肾制备肾组织匀浆，按照试剂盒说明书指导分别测定SOD 活性、MDA 含量和NO 含量。

1.2.6免疫组化(SP) 采用SP法测定肾组织中纤连蛋白、Cleaved Caspase-3、Bax 和Bcl-2 蛋白表达，显色结果在高倍镜下随机选取20个连续不重复的视野，计数每视野阳性细胞的百分率，取其均值表示该因子表达强度。所有操作内容严格按照说明书进行。

1.2.7Western印迹检测各组Bcl-2、Bax蛋白表达水平 取肾脏组织100 mg放入试管，剪碎，裂解液充分研磨，冰上裂解1 h，12 000 r/min离心15 min，取上清液，测蛋白浓度(Bio-Rad试剂盒)，分别取50 μg蛋白样本经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳分离蛋白后(于4%～12% SDS-PAGE)2 h，转至硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，与一抗(兔抗鼠，1∶100)37℃摇床孵育2.5 h，PBST洗涤后，与二抗(羊抗兔,1∶250)37℃摇床孵育0.5 h。PBST洗涤后经电化学发光(ECL)荧光显色，SMARTVIEW软件分析蛋白表达量。

1.3统计学方法 采用SPSS12.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1肾小体病理学改变 与Con组相比，DM组肾小球基底膜增厚，肾小球系膜基质增加，肾小球面积百分比增加，纤连蛋白表达百分比增加，差异具有统计学意义(均P<0.001)。与DM组相比，DM+PB组肾小球基底膜增厚减少，肾小球系膜基质增加减少，肾小球面积百分比减少，纤连蛋白表达百分比减少，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图1、表1。

图1 HE染色和纤连蛋白染色观察各组肾小体病理学改变(×100)

2.2肾组织中MDA、NO、GSH和SOD的表达 与Con组比较，DM组MDA、NO含量升高、GSH和SOD含量降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。与DM组比较，DM+PB组肾组织中MDA、NO表达均降低，GSH和SOD表达均升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组肾小球面积、纤连蛋白、肾脏中MDA、NO、GSH和SOD表达比较

2.3脂质代谢变化 DM组血浆TC、TG、FFA及肾脏TG含量均较Con组升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；DM+PB组血浆TC、TG、FFA及肾组织TG含量均较DM组下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.4Cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2表达 与Con组比较，DM组Cleaved Caspase-3和 Bax蛋白表达均增加，Bcl-2蛋白表达降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；与DM组比较，DM+PB组Cleaved Caspase-3和Bax蛋白表达均降低，Bcl-2蛋白表达增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2、图2、图3。

表2 白花丹素对糖尿病大鼠脂质代谢、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3表达的影响

图2 各组增强型化学发光试剂染色(×100)

图3 各组Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3表达

3 讨 论

研究表明，30%～40%的糖尿病患者合并DN〔1,2〕。大量研究表明DN发生和发展过程中出现氧化应激反应和脂质代谢异常〔3～5〕。白花丹素是百花丹等植物的自然提取物，研究报道白花丹素具有多种药理活性，包括抗炎、抗癌和抗菌等作用〔6,7〕。

过往研究发现氧化应激在DN的发生和发展过程中发挥着非常重要的作用〔8〕。MDA是反应机体氧化应激的一个良好指标，MDA的量可反映机体自由基的含量和脂质过氧化程度。NO在体内具有血管活性和细胞毒性的双重作用。能够将O2-转化为H2O2或O2，构成抗氧化应激的第一道防线。因此，SOD活力可反映机体抗脂质过氧化能力。本实验提示，白花丹素可改善糖尿病大鼠机体的氧化应激反应。 氧化应激通过激活线粒体、损伤DNA、影响NF-κB基因表达等诱导细胞凋亡〔8〕。细胞凋亡是一个由Caspase蛋白激酶家族介导的蛋白酶级联反应过程。Bcl-2基因家族是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族，属于一类新的癌基因家族；Bcl-2 和Bax 是Bcl-2 家族的两个重要成员，Bcl-2是抑制凋亡的主要基因，而Bax是促凋亡基因，它们和其家族成员共同构成了复杂的相互作用的网络，调控细胞凋亡的发生，两者比例失调则导致细胞凋亡。本实验表明，高血糖会引起糖尿病大鼠肾脏氧化应激损伤，诱发细胞凋亡。白花丹素可能是通过调节Cleaved Caspase-3、Bcl-2和Bax表达量，缓解氧化应激诱发的肾脏损伤，从而抑制糖尿病大鼠细胞凋亡。糖尿病发生和发展过程中伴随着脂质代谢紊乱，降低糖尿病脂质代谢对于糖尿病治疗具有非常重要的作用〔9,10〕。

综上，白花丹素可以降低糖尿病大鼠肾组织中MDA、NO表达，提高GSH和SOD含量，缓解氧化应激损伤；同时白花丹素降低糖尿病大鼠TC、TG、FFA以及肾组织TG含量减轻脂质代谢紊乱，对糖尿病肾病起到积极的治疗和保护作用。