右美托咪定对老年大鼠阑尾切除术术后认知功能障碍的影响及其机制

张臣 蔡灵乐 李浩田 王娜 谢毅 袁甲翔

(1郑州市第九人民医院普外科，河南 郑州 450053；2河南省人民医院普外科；3郑州大学第一附属医院微创外科)

术后认知功能障碍指患者手术前无精神和认知方面问题，但在麻醉术后患者发生不稳定的神经系统并发症〔1〕。术后认知功能障碍表现为自身认知能力大幅度下降、记忆功能衰退、生活及工作能力降低和患者情绪性格出现较大的变化，病情严重者可能出现患者人格变动〔1,2〕。老年患者术后认知功能障碍的发病率明显高于年轻患者，其原因是老年患者因其年龄过大，神经系统日趋老化，精神状态日益衰落，身体状态并不足以承受手术创伤和麻醉不良反应〔3,4〕。研究发现年龄>65岁的患者在接受非心脏手术后短期术后认知功能障碍发生率接近26%，长期术后认知功能障碍发生率约为10%〔5〕。随着我国老龄化的加剧，老年患者术后认知功能障碍增加在医院就诊住院时长、扩大当前相应的医疗资源缺口、增添家庭及社会医疗支出。不仅严重影响患者日后生活自由和品质，也增添了患者家庭经济压力和社会医疗支出。术中麻醉是老年患者术后认知功能障碍的重要诱因，因此优化麻醉手段是对老年患者快速康复外科的一个重要环节〔6,7〕。右美托咪定是一种高选择性肾上腺素能受体激动剂，手术中用作镇静剂和辅助剂，在重症监护室中用作镇静剂。通过与受体的结合使蓝斑神经元超极化抑制去甲肾上腺素释放。近些年研究表明右美托咪定具有保护神经元和抗感染作用〔8〕。本研究探究右美托咪定对老年大鼠阑尾手术术后认知功能的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及干预方式 4月龄SPF级雄性SD大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2019-0010。饲养12个月后，大鼠被随机空白组(n=6)、模型组(n=12)和治疗组(n=12)；对空白组大鼠不做任何操作；模型组和治疗组均使用七氟烷麻醉后行阑尾切除术；将大鼠放入Datex-Ohmeda型气麻机的麻醉箱中，使用输出浓度为2%的七氟烷对大鼠进行麻醉诱导，待大鼠麻醉后，使用输出浓度为1%的七氟烷对大鼠进行维持麻醉，使用脱毛膏对大鼠腹部进行脱毛，75%酒精消毒大鼠腹部后，在大鼠中下腹部正中切口，打开腹腔，撑开切口，迅速找到阑尾，然后在阑尾根部用止血钳夹住，在止血钳内侧用4-0号丝线扎紧，打外科结，再用剪刀剪除其外侧的阑尾，用含碘0.5%的安多福消毒阑尾残端，然后回纳，最后分层缝合腹部肌肉和皮肤。治疗组的大鼠在术前和术后24 h给予右美托咪定(100 μg/kg)治疗；3组大鼠的其他饲养条件完全相同。

1.2Morris水迷宫试验 试验原理：趋利避害是动物的本能，大鼠在水中有强烈的逃避水环境的愿望，并以最快、最直接的途径逃离水环境，学习逃离过程体现了大鼠的空间记忆力。由于水池内没有参照物，所以大鼠的有效安全定位能力需参考水箱外的结构。Morris水迷宫试验在术前4 d开始进行训练，每组每天训练4次(包括4个象限)，连续4 d。潜伏平台放在第一象限内，训练时依次从4个象限将大鼠放入水中，大鼠从入水到找到潜伏平台时间为本次逃避潜伏期，大鼠找到潜伏平台后让其在上面停留15 s，如果大鼠在90 s内未找到潜伏平台则人为将其引导上潜伏平台，同时逃逸潜伏期计为90 s，每天4个象限逃逸潜伏期平均值作为当天逃逸潜伏期。术后第2天开始对各组大鼠进行Morris水迷宫试验；在术后第2天开始对各组大鼠Morris水迷宫训练1次，在训练结束2 h后进行正式测试，测试时将潜伏平台移开，选定与潜伏平台相对的象限为入水点,记录大鼠90 s内穿过原平台位置的次数，连续测试4 d，计算每组大鼠每天的逃避潜伏期。

1.3血浆细胞因子水平检测 末次Morris水迷宫试验后，将各组大鼠进行麻醉，取各组大鼠外周血，离心分离血浆。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组血浆中白细胞介素(IL)-1β，IL-6，肿瘤坏死因子(TNF)-α水平，具体方法参照IL-1β，IL-6，TNF-α ELISA试剂盒说明书，其中IL-1β，IL-6，TNF-α ELISA试剂盒购于RD system公司。

1.4苏木素-伊红(HE)染色 末次Morris水迷宫试验后，将各组大鼠进行麻醉，取大脑海马组织，采用10%甲醛溶液固定组织24 h，然后将固定的组织脱水，石蜡包埋，制备石蜡切片。将制备的石蜡切片进行HE染色和TUNEL染色。将切片脱蜡固定后，使用山羊血清封闭，使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(绿色FITC标记荧光检测法，凯基生物)对大鼠海马区细胞凋亡情况进行分析，具体方法参照试剂盒说明书。

1.5实时荧光定量PCR(RT-PCR) 末次Morris水迷宫试验后，将各组大鼠进行麻醉，取大脑海马组织，采用Trizol法提取海马中RNA，然后反转录获得cDNA，采用RT-PCR检测海马组织中细胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α mRNA表达水平。IL-1β引物：上游5′-GATGTCGAGAGTCCCAATGA-3′，下游5′-GCTGGCATTCTGAGGCAAAA-3′；IL-6引物：上游5′-GATTAGCCGAGGTATAGCCA-3′，下游5′-ACTTGGAGCTTCGGACAAGA-3′；TNF-α引物：上游5′-GGCTAATTCAGTTAGGCGGC-3′，下游5′-CGGAGGACTTTGTAATGCAC-3′。

1.6Western印迹检测 末次Morris水迷宫试验后，将各组大鼠进行麻醉，取大脑海马组织，使用放射免疫沉淀(RIPA)裂解液对组织进行裂解。使用Western印迹对裂解液中Aβ、剪切的多聚ADP-核糖聚合酶(cleaved PARP)-1、剪切的半胱氨酸蛋白酶(cleaved-caspase)3、IL-1β、IL-6、TNF-α水平、核因子κB抑制蛋白(IκB)α磷酸化及细胞核内NF-κB p65核积累量进行分析检测，抗大鼠Aβ、cleaved PARP-1、cleaved-caspase3、代谢类蛋白(GAPDH)、IκBα、NF-κB p65、Lamin B1抗体均购于Abcam公司。

1.7统计学方法 采用GraphPad8.0软件进行t检验、秩和检验、方差分析。

2 结 果

2.1右美托咪定对老年大鼠阑尾切除术术后认知功能的影响 模型组术后2、3、4、5 d的Morris水迷宫测试逃避潜伏期较空白组显著延长(P<0.05)，而治疗组术后2、3、4、5 d Morris水迷宫测试逃避潜伏期较模型组显著缩短(P<0.05)，见表1。

表1 各组术后不同时点Morris水迷宫测试逃避潜伏期的比较

2.2右美托咪定对老年大鼠阑尾切除术术后血浆细胞因子水平的影响 与空白组比较，模型组血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高(P<0.05)，而治疗组大鼠血浆IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著低于模型组(P<0.05)，见表2。

表2 各组阑尾切除术术后5 d血浆IL-1β、IL-6、TNF-α水平变化

2.3右美托咪定对老年大鼠阑尾切除术术后海马组织细胞损伤的影响 空白组海马区神经元细胞整齐规则有序致密，细胞形态大小正常，细胞核清晰可见且分布规则，模型组海马区神经元细胞严重受损，排列无规则，细胞结构不清晰，细胞密度显著下降，染色较深，观察到神经细胞的核固缩，但是治疗组海马区神经元细胞受损程度相比于模型组显著改善，见图1。模型组海马组织中Aβ蛋白表达(2.33±0.15)较空白组(0.07±0.02)升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，而治疗组海马组织中Aβ蛋白表达(1.12±0.09)较模型组下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图1 各组海马组织HE染色(×400)

图2 Western印迹检测各组Aβ蛋白表达

2.4右美托咪定对老年大鼠阑尾切除术术后海马组织神经元细胞凋亡的影响 模型组海马区凋亡细胞数目〔(25.68±5.39)个〕较空白组〔(3.89±1.92)个〕增加，而治疗组海马区凋亡细胞数目〔(14.82±3.71)个〕较模型组降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。模型组海马组织中cleaved-caspase3和cleaved PARP1蛋白表达较空白组显著增加，而治疗组海马组织中cleaved-caspase3和cleaved PARP1较模型组显著下降(P<0.05)，见图4、表3。

图3 各组海马组织凋亡细胞数目TUNEL染色(×400)

图4 Western印迹检测各组海马组织cleaved PARP-1和cleaved-caspase3

表3 各组cleaved PARP1和cleaved caspase 3相对灰度值

2.5右美托咪定对老年大鼠阑尾切除术术后海马组织炎症反应的影响 模型组海马组织中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA和蛋白表达水平较空白组显著升高，而治疗组海马组织中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA和蛋白表达水平较模型组显著降低(P<0.05)，见表4、表5、图5。

图5 Western印迹检测各组IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达

表4 各组IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达水平变化

表5 各组IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达比较

2.6右美托咪定对老年大鼠阑尾切除术术后海马组织NF-κB通路的影响 与空白组比较，模型组海马组织中IκBα磷酸化水平、NF-κB p65蛋白表达升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，治疗组海马组织中IκBα磷酸化水平、NF-κB p65蛋白表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图6、表6。

图6 Western印迹检测各组IκBα磷酸化、NF-κB p65蛋白表达

表6 各组IκBα磷酸化、NF-κB p65比较

3 讨 论

认知功能损害是一种主要表现为注意力、记忆力和信息处理能力下降的围术期认知功能障碍，严重影响了老年患者术后的生活质量。针对这类围术期并发症，加速康复外科的应用显得尤为必要。加速康复外科理念是将围术期有循证医学证据的措施加以整合，将多个学科的最新研究证据相结合的一种集成新理念,它强调减少围术期的各种应激，以促进患者术后各器官功能尽快康复、减少围术期的各种并发症、缩短患者的住院时间〔9〕。如术前更为人性化的心理疏导及术前准备，术中微创手术的实施，外科、麻醉科、麻醉护士的协调配合，术后的镇痛，不安放或尽早拔除引流管等〔9〕。老年患者围术期认知功能障碍主要是由于麻醉对神经元损伤引起的，因此合理的麻醉方式是针对老年患者加速康复外科的主要研究方向。

右美托咪定除了具有镇定作用外，还具有抑制神经元细胞凋亡〔10〕。但是其对老年急腹症术后认知功能的作用尚不得知。本研究在老年大鼠上行阑尾切除手术，通过Morris水迷宫检测大鼠术后的空间学习能力。Morris水迷宫利用重复试验评估学习和空间定位导航能力，已被证明是一种稳健可靠的测试并获得广泛认可，被广泛应用在学习记忆，阿尔茨海默病、神经生物学等诸多领域〔11〕。Aβ的沉积不仅与神经元的退行性病变有关，而且可以激活一系列病理事件，具有很强的神经毒性作用。本研究结果表明右美托咪定能够显著改善老年大鼠阑尾切除术术后认知功能障碍。

神经炎症是认知功能障碍发生的重要原因，而研究表明右美托咪定具有改善抑制炎症反应的功能〔12,13〕。本研究结果表明，右美托咪定干预能够显著降低老年大鼠阑尾切除手术引发的机体炎症及神经炎症。NF-κB信号通路在炎症反应中起重要作用，其控制转录的DNA、细胞因子产生。静默状态下NF-κB分子与IκB分子结合在一起，分布在细胞质中，当机体受到刺激后，IκB分子会发生磷酸化，磷酸化后的IκB与NF-κB分子分离，继而NF-κB分子进入核内调控生物学活动。研究发现NF-κB信号通路通过促进水肿组织及创面中的炎症反应，阻碍组织水肿恢复及创面愈合〔14,15〕。