柱前荧光衍生-离子液体微萃取-高效液相色谱法测定发酵食品中生物胺

李 宏， 史 巧， 王馨蕊， 陈骏飞， 肖飞健， 杨亚玲*

(1.云南省农业科学院农产品加工研究所，云南昆明 650033；2.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明 650500)

生物胺(Biogenic amines，BAs)是一类低分子量、具有生物活性的有机碱，主要由醛、酮类物质在转氨酶的作用下形成，或者游离氨基酸在微生物的脱羧作用下产生，常见的生物胺包括酪胺、组胺、腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、精胺和亚精胺等[1,2]。生物胺广泛存在于食品中，尤其是酿造酱油、植物酵素、酒类等发酵食品中。摄入过量的生物胺，会对人体健康造成不良影响[3,4]，目前生物胺测定方法有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、薄层色谱法(TLC)等[5 - 8]。高效液相色谱-串联质谱法具有检测灵敏度高、分析速度快等优点，但对仪器和技术要求高。由于生物胺类具有热不稳定性，气相色谱法和气相色谱-串联质谱法的应用也受到限制，因此高效液相色谱法是检测生物胺含量的主要手段。多数生物胺除组胺之外无发光基团和荧光反应，需要对其进行衍生化处理，才能在色谱仪上进行检测，常用的衍生试剂有丹磺酰氯、苯甲酰氯、邻苯二甲醛等，其中丹磺酰氯(Dns-Cl)是生物胺检测中最常用的衍生试剂，所得衍生物性质稳定且保存时间长，但其衍生过程繁琐复杂，且耗时较长，不利于样品的快速测定[9 - 13]。荧光胺能与化合物中的芳伯胺基生成高度荧光衍生物，且反应条件简单，反应迅速。Akiko K等人在研究中采用荧光胺对生物胺进行衍生，然后利用液相色谱进行分离检测，为本研究提供了较好的参考价值[14,15]。

食品样品中生物胺的测定需要进行样品制备，以除去样品基质的干扰，并在HPLC分析前对分析物进行预浓缩[16]，液液萃取(LLE)[17]和液相微萃取(LPME)[18]是样品前处理最常用的方法。分散液液微萃取是一种集采样、萃取和浓缩于一体的样品前处理技术，具有操作快速、所需仪器简单、萃取费用低、对环境友好等优点。离子液体作为一种新型的极性溶剂，几乎不需要较高的萃取温度，并且具有不可燃性、非挥发性、良好的化学稳定性和热稳定性，且离子液体可循环利用，对环境友好，故称之为“绿色”化学溶剂，可以用来代替传统的易挥发有毒溶剂，在食品样品前处理及分析中备受关注[19,20]。

本研究报道了一种柱前荧光衍生-离子液体液液微萃取(IL-DLLME)结合HPLC测定发酵食品中生物胺的新方法。生物胺与荧光胺反应形成具有强烈荧光的衍生物(图1)，以乙腈-甲醇-乙酸缓冲液作为流动相，并且以疏水性1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐作为萃取剂，1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐作为分散剂，进行生物胺的荧光胺衍生物萃取，由于衍生物与萃取剂良好的极性匹配性，可以达到较好的萃取效果，不仅降低基质的干扰，还可以提高检测灵敏度，可用于发酵食品中生物胺的测定。

图1 IL-DLLME-HPLC测定生物胺示意图Fig.1 Schematic illustration of IL-DLLME-HPLC detection of BAs

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪，附荧光检测器(美国，Agilent Technologies)，带C18反相分析柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；XW-800快速混匀器(上海汗诺仪器有限公司)；HC-3018R型高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；pHS-3B精密酸度计(德国赛多利)；78-1型磁力加热搅拌器(上海南汇电讯器材厂)；AB204-S电子分析天平(梅特勒-托利多)。

组胺、尸胺、腐胺盐酸盐(国家有色金属及电子材料分析测试中心)；1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C8MIm][PF6]，上海国药)；1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([C4MIm]BF4，上海国药)；荧光胺(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)。所用试剂均为分析纯，实验用水均为去离子水(18.25 MΩ·cm)。

市售泡小米辣、榨菜和酱腌菜样品，购自于昆明市呈贡区超市。

1.2 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；荧光检测波长：激发波长388 nm，发射波长490 nm；进样量：20 μL；柱温：40 ℃；流速：1 mL/min。流动相A：乙腈-甲醇(体积比为1∶1)；流动相B：HAc-NaAc缓冲溶液；梯度洗脱：0～16 min，30%～60%A；16.00～16.10 min，60%～90%A；16.10～22.00 min，90%A；22.00～22.10 min，90%～30%A；22.10～25.00 min，30%A。

1.3 衍生化方法

液相小瓶中依次加入200 μL生物胺混合标准溶液(或实际样品提取液)、200 μL 3.0 mol/L NaAc及100 μL 0.2%荧光胺丙酮溶液，涡旋混匀30 s，暗处衍生20 min，衍生后体系由无色变为黄色，且带有强烈的黄色荧光，衍生化反应如下：

1.4 IL-DLLME方法

将衍生溶液用去离子水定容到10 mL，快速注入150 μL [C8MIM]PF6和300 μL[C6MIM]BF4的混合液，旋涡混合1 min，此时管内形成黄白色乳浊液，以8 000 r/min离心5 min，管内溶液分层，离子液体沉积到下层，且呈黄色。用注射器针尖取出黄色层溶液，用乙腈定容至1 mL，过0.22 μm滤膜后，取20 μL供HPLC分析。其测定示意图如图1所示。

1.5 样品前处理方法

称取泡小米辣、榨菜和酱腌菜经匀浆处理混匀样品1.00 g于15 mL离心管中，加入5 mL HClO4，于30 ℃水浴温度下超声提取30 min，过滤不溶物，取滤液用Na2CO3溶液调节pH至中性，用去离子水定容后待衍生化。

2 结果与讨论

2.1 液液微萃取条件优化

2.1.1 萃取剂及分散剂的选择对于生物胺的液液微萃取研究不多，有研究采用低共熔溶剂液液微萃取[21]，主要原因是生物胺是极性分子，在水中溶解度大，不能使用常规分散液液微萃取的萃取剂，如三氯甲烷、四氯化碳、氯苯、二硫化碳等进行。将生物胺进行荧光衍生后，其衍生物的极性减小，研究用无毒疏水性的离子液体作为萃取剂，考察了[C4MIM]PF6、[C5MIM]PF6、[C6MIM]PF6、[C7MIM]PF6及[C8MIM]PF6等5种离子液体。采用亲水性离子液体作为分散剂，考察了[C4MIM]BF4及[C6MIM]BF4两种离子液体对萃取效率的影响，如图2。[C4MIM]PF6在水中有一定的溶解度，当[C8MIM]PF6与[C6MIM]BF4组合后，既保证了极性的匹配，又有合适的粘度。实验中选择此组合为萃取剂及分散剂，并同时考察了其用量(图3)。实验结果表明，当萃取剂体积小于150 μL时，萃取剂体积不足会导致萃取不完全；当萃取剂用量大于150 μL，萃取效率变化不明显，遵循环保经济的原则，选择萃取剂用量为150 μL。当分散剂体积小于300 μL时，随着用量增加分散剂能使萃取剂与样品溶液接触几率增加，萃取效率不断增强；当分散剂体积大于300 μL时，萃取效率反而降低，可能是因为分散剂用量过多稀释样品溶液，从而间接影响了萃取效率，因此选用萃取剂体积为150 μL，分散剂体积为300 μL。

图2 萃取剂种类的选择Fig.2 The effect of different extractant type

图3 萃取剂用量(A)和分散剂用量(B)对萃取效率的影响Fig.3 Effect of extractant dosage(A) and dispersant dosage(B) on extraction efficiency

2.1.2 pH与温度的影响大多数IL-DLLME方法是在中性条件下进行的，但[C8MIM]PF6在中性条件下，萃取率较低。实验在pH 2.2～10范围内考察了pH对萃取效率的影响。结果如图4A，在pH=3时，萃取率较大，而pH在4～10时，萃取率逐渐减小，可能高pH条件下会对衍生物的稳定性产生影响，导致萃取回收率降低，故实验选择pH=3条件下进行反应。

此外，实验还研究了温度对萃取结果的影响,结果如图4B所示，在室温25 ℃下萃取率最高，因此本实验选择室温25 ℃下萃取。

图4 不同pH值(A)和温度(B)对萃取率的影响Fig.4 Effect of different pH value(A) and temperature(B) on the extraction efficiency

2.1.3 盐效应由于盐能够改变溶液的离子强度，在IL-DLLME中加入一定浓度的NaCl溶液，研究发现盐浓度对萃取体系回收率影响不大。

2.2 方法分析性能

图5 标准样品的IL-DLLME-HPLC-FLD色谱图Fig.5 Chromatograms of BAs with the pre-column fluorescent derivatization and DLLME

2.2.1 线性回归方程、检出限与定量限分别取生物胺(组胺、腐胺、尸胺)混合标准使用液0.025、0.050、0.100、0.150、0.200 mL，按照衍生化方法进行处理后，分别取各浓度混合标准工作液20 μL进样，加入离子液体进行萃取，萃取前后色谱图如图5。由图5可见，经IL-DLLME处理后，检测灵敏度得到较大提高。依据生物胺峰面积Y和生物胺含量X进行线性回归，所得各生物胺衍生物的线性回归方程、相关系数、检出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)见表1，线性相关系数均大于0.996，检出限为0.39～0.91 mg/kg，定量限为1.52～5.36 mg/kg，具有灵敏度高的特点，能够用于生物胺的灵敏检测。

表1 3种生物胺衍生物的线性回归方程、相关系数、检出限、定量限

2.2.2 方法回收率和精密度及样品分析在优化后的提取条件下，将所建立的方法用于腌菜、榨菜、小米辣中的生物胺分析，结果在3种样品中均检出生物胺(表2)。为评价方法的准确度和适用性，设置添加浓度为5、25、50 mg/kg的3种生物胺，平行测定3次，计算其回收率。由表3可知，3种生物胺在腌菜、榨菜和小米辣中的回收率为81.0%～108.7%，表明该方法具有良好的准确度和适用性。3种生物胺的相对标准偏差均在1.7%到5.9%之间，表明该方法具有良好的精密度。

表2 腌制品中生物胺含量的测定结果(n=6)

表3 腌制品中生物胺含量加标回收率和相对标准偏差(RSD)

3 结论

建立了发酵食品中3种生物胺的测定方法，对提取液中的生物胺进行衍生化处理后，采用离子液体作为萃取剂和分散剂对衍生产物进行萃取，结果表明，样品中的生物胺经过衍生萃取进行富集后，降低了检测的检出限。该方法具有简便、快速和灵敏度高等优势，且具有良好的适用性。