红米苋酵素发酵工艺及抗氧化活性研究*

徐亚萍，邱成书，伍 勇，张晓娟，梅婷婷，夏 珊，刘红玲

(成都师范学院化学与生命科学学院，四川 成都 611130)

0 引言

红米苋(AmaranthustricolorL.)是一种在全国各地及东南亚地区生长的保健草本植物，它的枝干及叶片中含有十分丰富的苋菜红素；苋菜红色素是一种易溶于水的含氮有机物，具有高抗癌、抗氧化、降血脂，保护眼睛等药用价值[1]，与花青素不同，属于甜菜素类；它是一种具有较高生理活性的天然色素[2]。因此，红米苋是一种营养价值及其丰富的植物。目前，它的利用方式还比较单一，主要用于为蔬菜用以烹调使用或者少量用于提取苋菜红素用作天然色素添加剂。

红米苋的生长条件或苋菜红素的提取条件和方法有报道[2-4]，而用其来制成酵素的研究却甚少。为了进一步充分利用苋菜的营养价值，采用将红米苋制作成酵素的方法以期赋予苋菜更好的益生功能，有助于肠胃吸收。同时产生各种风味物质，提高苋菜应用的经济效益，开拓苋菜广阔的应用前景，更受到消费者的欢迎。为更好利用红米苋，本研究以红米苋提取液为原料，用酵母菌发酵成红米苋酵素；测定青、红红米苋酵素的组分含量、相关酶活力及抗氧化活性来对比研究二者在制作成酵素的品质上面是否会有所不同，以确定最佳采摘期，以及甜菜素是否会影响酵素品质，为红米苋酵素的制作提供研究理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

材料：红米苋购买于永辉超市；安琪酵母(干酵母)购买于永辉超市；白砂糖(一级品)市售(购买于永辉超市)。

芦丁(C27H30O16)乙醇(C2H6O2)；亚硝酸钠(NaNO2)；六水合三氯化铝(AlCl3.6H2O)；氢氧化钠(NaOH)；没食子酸(C7H6O5)福林试剂；碳酸钠(Na2CO3)；Tris(C4H11NO3)；邻苯三酚(C6H6O3)；盐酸(HCL)；L-酪氨酸(C9H11NO3)铁氰化钾(K3[Fe(CN)6)、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺盐(ABTS、三氯乙酸(C2HCl3O2)、水杨酸(C7H6O3)、磷酸氢二钠(Na2HPO4))、过硫酸钾(K2S2O8)、α—二苯基—β-苦苯肼(DPPH)、甲醇(CH3OH、磷酸二氢钾(KH2PO4)、三氯化铁(FeSO4)、硫酸亚铁(FeSO4)：均为分析纯；实验过程中无特殊要求外，都采用蒸馏水。

1.2 仪器与设备

电子分析天平(FA2004)，常州市幸运电子设备有限公司；恒温水浴锅(HH-W420)，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；KDC-1044低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；pH计(PHS-3E)，上海仪电科学仪器股份有限公司；紫外分光光度计(UV754)，上海菁华科技仪器有限公司。电热恒温培养箱(YHSP-150)，上海玺恒实业有限公司；超净工作台(VS-840-1)，上海博讯实业有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酵素的制备

酵母选用干的安琪酵母、料液比1∶5、糖液比1∶5。发酵罐进行巴氏灭菌5 min、将买回的原料进行洗净、去梗、榨汁(料液比1∶5)、过滤处理后分别装罐(糖液比1∶5)，酵母添加量均为0.5%。青苋菜和红苋菜的发酵罐分别设置三个重复。装料后的发酵罐紫外灭菌24 h，在恒温培养箱30℃发酵培养35 d：清洗、挑选→榨汁→装料→装罐→紫外灭菌→接种酵母菌→发酵培养→灭菌。

1.3.2 发酵液成分含量的测定

1.3.2.1 黄酮类化合物的测定

黄酮类化合物的测定，参照周颖等人测定方法[5]。

1.3.2.2 总酚含量的测定

红米苋酵素中总酚含量测定参照徐辉艳等人测定的方法[6]。

1.3.2.3 苋菜红色素含量变化的测定

参考玛尔孜娅·阿不力米提等人的方法[7]。

1.3.3 酶活性的测定

1.3.3.1 蛋白酶活性的测定

参照邵颖等[8]测定蛋白酶活性的方法。其计算公式如下：

式中：X-苋菜酵素溶液中的酶活力(U/mL)；A-由标准曲线计算得出的酵素稀释液的蛋白酶活力(U/mL)；4-反应试剂的总体积(mL)；n-稀释倍数；10-反应时间为10 min，以1 min计。

1.3.3.2SOD酶活性测定

SOD酶活性测定参照沙如意等[9]采用邻苯三酚自氧化的方法。其计算公式如下：

式中：V1-反应液总体积，mL；V2-测定样品体积，mL；ΔA0-邻苯三酚的自氧化速率；ΔASOD-样品OD值变化速率；n-稀释倍数。

1.3.4 抗氧化性的测定

1.3.4.1 还原力的测定

发酵液还原力测定参照Oyaizu[10]等方法略作修改。

1.3.4.2 羟基自由基清除能力的测定

羟自由基清除能力测定参照王小华等[11]水杨酸-硫酸亚铁法测定。

1.3.4.3 DPPH自由基清除力的测定

参照蒋增良[12-14]等的方法测定了DPPH自由基清除率。

1.4 数据分析

本实验的数据处理利用SPSS.25进行数据分析，excel2010进行绘图和数据整理。

2 结果与分析

2.1 红米苋酵素发酵液中部分活性物质含量变化

2.1.1 红米苋酵素黄酮类化合物含量变化

以吸光度值为纵坐标，芦丁浓度为横坐标绘制黄酮类似物标准曲线(图1(a))，图中可以看出：Y=13.625X-0.106，R2=0.9943，相关系数0.99714，表明标准曲线线性关系好，方法可信度高。

图1 红米苋酵素黄酮类化合物含量变化趋势图Fig.1 Change trend of flavonoids in Amaranthus tricolor extract

在同样条件下，测定青、红米苋酵素发酵液黄酮类似物的含量变化(图1(b))。从图中可以看出：发酵的前20 d内，青红、红红米苋酵素发酵液中黄酮类化合物随时间缓慢增加，增加幅度极小。第21天开始，红米苋酵素发酵液中黄酮迅速增加，并且在第28天时候达到峰值0.0118 g/L，28天之后随时间推移，其黄酮类似物的含量逐渐降低，到第35天与青米苋酵素发酵液黄酮含量相近。而青米苋酵素发酵液中的黄酮类似物含量在第20天达到最大值，随后缓慢下降。在第28天左右，红米苋酵素的黄酮类似物含量显著高于青米苋。

2.1.2 苋菜酵素总酚含量变化

以吸光度值为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标绘制总酚标准曲线(图2(a))。图中可以看出：Y=7.74X-0.0043，R2=0.9965，相关系数0.99824，表明标准曲线线性关系良好，方法可信度高。在与标准曲线相同条件下，测定苋菜酵素发酵液中的总酚含量(图2(b))。从图中可以看出：在发酵过程中，两种苋菜酵素发酵液中，总酚含量变化十分明显。发酵开始时红米苋酵素发酵液中总酚含量高于青米苋酵素发酵液；0～21天期间，红米苋酵素发酵液中总酚含量一直增加，且到21天达到峰值，21～28天期间，总酚急剧降低，28天后缓慢降低；且在21天后，发酵液中总酚含量一直低于青米苋酵素发酵液。发酵开始至第7天期间，青米苋酵素发酵液中的总酚含量几乎没有变化，第7天以后急剧升高，到第21天是总酚含量达到最高值，两种酵素总酚含量差异不显著，第21天后，发酵液中总酚含量缓慢降低；28天后则急剧下降。

图2 红米苋酵素总酚含量变化趋势图Fig.2 Change trend of total phenols in Amaranthus tricolor extract

2.1.3 红米苋酵素中苋菜红素含量的变化

红米苋酵素中苋菜红素测定结果见图3，从图中可知：随发酵时间的推移，两种苋菜酵素发酵液中的吸光度都逐渐下降，表明发酵液中的苋菜红素含量逐渐降低，且整个发酵过程中红米苋酵素中苋菜红素含量在发酵过程中一直都是显著高于青红米苋酵素中的苋菜红素含量。

图3 红米苋酵素苋菜红素吸光度变化趋势图Fig.3 Change trend of amaranthine in Amaranthus tricolor extract

2.2 红米苋酵素的酶活力的变化

2.2.1 苋菜酵素的蛋白酶活力变化

以吸光度值为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标绘制蛋白酶标准曲线(图4(a))。从图中可以看出：Y=0.0093X-0.0939，R2=0.9993，相关系数0.99964，表明方法可靠性高。采用相同条件，测得苋菜酵素发酵液的蛋白酶含量如图4(b)。由图中可知：两种米苋酵素发酵液中的蛋白酶随发酵时间推移，都缓慢增长，发酵至35天达到最大值；且两种米苋酵素发酵液中的蛋白酶活性相差不大。

图4 红米苋酵素的蛋白酶活力变化趋势图Fig.4 Change trend of protease activity in Amaranthus tricolor extract

苋菜酵素在发酵过程中，青红、红红米苋酵素中的蛋白酶活力也随着发酵时间变化(图4)，由图可知：在0～28 d的这段时间内青、红苋菜酵素的蛋白酶活力都出现了稳定的增长，在28 d之后青红、红红米苋酵素的蛋白酶活力的增长速度较前段时间增长得更加迅速。在发酵的这段时间内青红、红红米苋酵素的蛋白酶活力都处于增长的趋势中，在35 d的时候达到了最大值。红红米苋酵素的蛋白酶活力的最大值是7.24 U/mL，青红米苋酵素的蛋白活力的最大值是8.14 U/mL。

2.2.2 苋菜酵素的SOD酶活力的变化

根据SOD酶活性测定和计算公式，两种米苋酵素发酵液中SOD酶活性结果如图5。从图中可以看出：发酵初期青红、红红米苋酵素的SOD酶活力缓慢增长。红苋菜酵素14 d～21 d快速增加，到第21天达到最大值115.93 U/mL，在21 d～35 d青苋菜呈下降趋势。而青、红米苋酵素在前期的时候增长缓慢，在后期的发酵过程中SOD酶活力呈缓慢下降趋势。在64.67U/mL时青苋菜酵素的SOD酶活力达到最大值。青红米苋酵素与红红米苋酵素的SOD酶活力存在较明显差异，且红红米苋酵素中SOD酶活力在整个红米苋酵素的发酵周期中都显著高于青红米苋酵素的SOD酶活力。

图5 红米苋酵素的SOD酶活力变化趋势图Fig.5 Change trend of SOD enzyme activity in Amaranthus tricolor extract

2.3 抗氧化活性

2.3.1 还原力

还原性是抗氧化性的一种，通过自身失去电子来具有保护其他物质不被氧化，在抗氧化活性中起重要作用[22]。

还原力是抗氧化性的一种能力，实验的两种米苋酵素发酵液的还原力结果如图6。从图中可以看出：发酵过程中，两种发酵液的还原力与发酵开始相比，都呈增加趋势。红米苋酵素发酵液在0～21天期间，还原力逐渐升高，第21天达峰值；第21天之后随发酵时间推移，逐渐降低，21～28天期间，还原力降低较明显，而21～35天期间，还原力降低较慢；总体来看，红米苋酵素的还原力最高值比青米苋酵素要高。发酵至第28天期间，青米苋酵素发酵液中还原力逐渐增加，变换幅度较小，到第28天达最大值；第28天之后缓慢降低。

图6 红米苋还原力随时间变化趋势对比图Fig.6 Change trend of reducing power of Amaranthus tricolor extract

2.3.2 羟自由基清除率

采用水杨酸法测定两种米苋酵素发酵液羟自由基清除能力，实验结果见图7。由图7可以发现：实验过程中所有红米苋酵素的清除率随时间的增长呈现一种先增大后减小的趋势，青红米苋酵素在14天取得最大的清除率，高达82.59%。相比而言，青米苋酵素发酵液羟自由基清除能力要弱不少。

图7 红米苋羟自由基清除率随时间变化趋势对比图Fig.7 Change trend of hydroxyl radical scavenging rate of Amaranthus tricolor extract

羟自由基是生物生命活动中产生的具有非常强的电子能力的自由基，由于其反应速度快、毒性强且活性高，可导致损伤细胞膜，产生不同的疾病[23]，羟自由基清除率是采用的水杨酸法利用Fe2+与H2O2混合产生羟自由基，通过测定在反应体系中水杨酸捕捉自由基产生有色物质的吸光度来得到羟自由基清除率[24]。

2.3.3 DPPH自由基清除率

采用DPPH法测定两种米苋酵素发酵液自由基清除能力见图8：两种米苋酵素的DPPH自由基清除力随时间的增加呈现一种先增后减的趋势，大约在21天达到最大值，两个的清除率也在80%以上，青红米苋酵素的自由基清除率为81.45% ，红红米苋酵素的自由基清除率为82.71%。

图8 红米苋DPPH清除率随时间变化趋势对比图Fig.8 Change trend of DPPH scavenging rate of Amaranthus tricolor extract

3 讨论与结论

3.1 讨论

3.1.1 红米苋酵素发酵液中部分活性物质含量影响

在发酵过程中，青米苋酵素与红米苋酵素中黄酮类化合物含量达到峰值的时间不同，可能与红米苋素提取液中存在未知组分或是同一组分含量相差太大存在密切关系，具体原因在后续研究揭示。发酵至28天时，红米苋酵素中黄酮类化合物含量达到峰值为0.1178 mg/g；与生姜酵素中黄酮类化合物的含量[15]相似。

微生物代谢活动使发酵原材料中的结合态的酚类物质转变为游离态酚类物质，使发酵液中总酚含量升高，提高了酚类物质的产量；让酚类物质更好被利用，提高其利用率。米苋酵素发酵液中酚类变化趋势呈现先增后降趋势，与蒋增良等研究蓝莓发酵过程中蓝莓“酵素”抗氧化活性的变化趋势一致[14，16]。

3.1.2 红米苋酵素的酶活性的影响

研究表明：超氧化物歧化酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等功效酶是植物酵素发酵液中功能活性物质[17]。提高蛋白酶活力对机体有诸多益处[18]。

青、红米苋酵素发酵过程中酵素的蛋白酶活力都增长缓慢，在整个发酵周期中蛋白酶活力比其它研究中的植物酵素中蛋白酶活力低。可能是在对蛋白酶活力测定时过滤操作不当，样液中含有杂质，影响了蛋白酶活力的测定。

红红米苋酵素在整个发酵周期中SOD酶活力都显著高于青红米苋酵素的SOD酶活力。SOD酶活力变化呈现一个先增加后降低的趋势，红米苋酵素在21天时达到最大值为115.9281 U/mL。

3.1.3 抗氧化活性

红米苋酵素还原力间于0.15～0.35，表明苋菜红素具有一定的抗氧化活性，但是未提纯的天然色素含有大量杂质，是导致还原力下降的一个重要因素；此外加上发酵会产生部分活性因子，如多酚、酮类，导致还原力下降，因此是否添加酵母及青红红米苋原料未出现相关规律，在这部分还需要再进行相关的实验探究[19]。

试验表明：红米苋中的苋菜红素对羟自由基有明显的清除效果，并且清除效果随浓度升高而增强；在发酵14天时的酵素与有关文献[3]提取苋菜中苋红素测其羟自由基清除率相比，清除率更高；与黑加仑酵素[20]相比，增幅相当，最大清除率也达到90%以上。随着发酵时间推移，酵母在酵素发酵过程中也会促进产生相关的酚类、酮类物质[3]，与发酵液中诸如苋红素等物质相互作用形成不具生理活性接合态物质，降低了自由基清除率。

红米苋本身中存在黄酮、多酚等物质对DPPH自由基、羟自由基有良好的清除作用，并随浓度的增加清除效果更高[2]。红米苋提取液含有的苋红素极易溶出，以及发酵液中存在大量的酚类物质，苋红素酵素对DPPH自由基有较好的清除力。在前期过程中，红米苋酵素的清除力明显高于青红米苋的清除力，与羟自由基清除力相似。红米苋酵素在发酵过程中，酵母代谢会促进青、红米苋酵素慢慢释放相关的酚类物质，与酵素中的苋红素等物质相互作用，进而降低了对DPPH自由基的清除力[21]。酚类物质会在红米苋酵素发酵过程中慢慢释放导致酵素溶液中酚类物质的增加，进而使酵素的抗氧化活性升高，清除力变大，酚类物质在红米苋酵素发酵进行过程中已基本溶出，溶出速率趋于平稳，在后续发酵过程中，酵素渐渐产生其他活性物质，与其相互作用导致活性降低[3]，逐渐趋于平稳。发酵在最初的21天内逐步增加，之后有所下降，总体趋于稳定。与银耳蓝莓酵素相比，银耳蓝莓酵素[22]的DPPH自由基清除率在60%～85%，红米苋酵素DPPH自由基清除率较之最大值高一些，达94%，但是最小值才20%，可能是由于苋菜红素不稳定，易分解造成。发酵至14天时，米苋酵素发酵液与张瑞等提取苋菜中苋红素的DPPH自由基清除率相比，清除率更高[3]。

3.2 小结

综合实验研究指标发现发酵至21天时红米苋酵素达到最佳状态。对比分析青、红米苋酵素发酵液的各项指标实验数据，发现红苋菜酵素质量更优于青苋菜酵素质量。制备红米苋酵素，选用红米苋作为原材更为合理。