响应面法优化大蝎子草水溶性总黄酮提取工艺及其水提液抗氧化活性分析*

董 贺，李 军，晋海军，唐晓琴，赵泽林，孙恒灿，张丽艳

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

大蝎子草是荨麻科蝎子草属植物大蝎子草(Girardiniadiversifolia(Link)Friis)的新鲜或干燥的全草，其为贵州省苗族、布依族等少数民族民间用药，主要分布于贵州、云南、四川等地。大蝎子草用药历史悠久，《楚彝本草》、《滇药录》、《藏本草》等均有记载，其味苦、辛，性凉，有小毒，具有祛风除湿，活血化瘀的功效，常用于治疗风湿麻木，跌扑损伤，骨折，坐骨神经痛，肾炎等[1]。截止到目前为止，对大蝎子草的研究以及报道较少，且相关文献大多数为药理研究[2-5]，对其黄酮类化合物研究极少，黄酮类化合物具有抗氧化、抗病毒，保肝、抗癌、抗炎等药理作用，并且植物源黄酮类化合物具有天然低毒的特点[6]。本文采用回流提取的方式来提取大蝎子草水溶性总黄酮，通过Box-Behnken响应面法优化其提取工艺，并设计其抗氧化活性试验，为后期大蝎子草研究提供依据。

1 仪器与材料

1.1 试验药材与试剂

试验用大蝎子草均产自贵州贵阳，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为荨麻科蝎子草属植物大蝎子草(Girardiniadiversifolia(Link)Friis)的干燥全草。芹菜素对照品(成都普思生物科技股份有限公司，含量≥98%，批号：PS010177)；DPPH(源叶生物科技有限公司，含量≥98%，批号：S08GS160451)；ABTS+(上海麦克林生化科技有限公司，含量≥99%，批号：C12819523)；过硫酸钾(上海麦克林生化科技有限公司，含量≥99%，批号：C13043573)；维生素C(天津市科密欧化学试剂有限公司，含量≥98%，批号：20191202)；乙醇(重庆川东化工(集团)有限公司，含量≥99.7%)为分析纯，蒸馏水，超纯水均由贵州中医药大学药物分析实验室提供。

1.2 仪器

电子分析天平(梅特勒托勒斯，XS205)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；紫外分光光度计(岛津企业管理(中国)有限公司，型号：UV-2501PC)；数显恒温水浴锅(上海浦东物理光学仪器厂，HH-4)。

2 方法

2.1 标准曲线的制作

参照徐旖旎等[7]的方法，准确称取10.05 mg的芹菜素标准品，置于25 mL容量瓶中，乙醇溶解并定容至刻度，精密吸取溶液3 mL，以60%乙醇定容于25 mL容量瓶中，得质量浓度为0.04824 mg/mL的芹菜素标准溶液。分别精密吸取上述标准溶液1mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL于25 mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度。以95%乙醇为空白对照，在269 nm下测定其吸光度值。以芹菜素浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制芹菜素标准曲线。

2.2 大蝎子草水溶性总黄酮提取及含量测定

精密称取10 g大蝎子草干燥药材，按照一定的浸泡时间、料液比和提取时间进行提取，抽滤，所有样品均提取两次，合并两次滤液，浓缩至50 mL，精密吸取2 mL浓缩液，水浴挥干，用60%乙醇进行溶解并定容于25 mL容量瓶中并精密吸取2 mL溶液，95%乙醇定容于25 mL容量瓶中，作为待测液，按“2.1”项下方法测定吸光度并计算待测液中水溶性总黄酮得率。水溶性总黄酮得率公式：

(1)

式(1)中：W为大蝎子草水溶性总黄酮得率(%)；C为水溶性总黄酮的浓度(mg/mL)；V为待测液液体积；X为稀释倍数；M为大蝎子草质量(mg)。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

按“2.1”项下方法测定芹菜素对照品溶液吸光度6次，计算RSD为0.38%，表明精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

按“2.2”项下方法提取水溶性总黄酮，分别在0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min时按照“2.1”项下的方法测定吸光度值，计算的RSD为0.27%，表明大蝎子草水溶性总黄酮提取液在150 min内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验

按“2.2”项下方法提取6样品溶液，计算其水溶性总黄酮含量RSD为0.42%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 加样回收率试验

精密称取5 g已知含量大蝎子草干燥药材6份，标准品加入量与所取供试品含量之比为1∶1的比例加入芹菜素标准品，按“2.2”项下方法制备待测液溶液，并计算回收率，平均回收率为101.46%，RSD为1.55%。

2.4 单因素试验

分别考察浸泡时间(0 min、30 min、60 min、90 min、120 min)、料液比(1∶10 g/mL、1∶14 g/mL、1∶18 g/mL、1∶22 g/mL、1∶26 g/ mL)、提取时间(30 min、60 min、90 min、120 min、150 min)对大蝎子草水溶性总黄酮得率的影响。

2.5 响应面试验设计

以大蝎子草水溶性总黄酮含量(Y)为响应值，浸泡时间(A)、料液比(B)、提取时间(C)为影响因素，设计3因素3水平响应面试验，各因素水平见表1。

表1 设计实验因素与水平Tab.1 Factors and levels of the experiment

2.6 抗氧化活性测定

2.6.1 DPPH自由基清除能力测定

参照桂利利等[8]的方法，略有改动。配置浓度为0.1 mmol/L的DPPH溶液。分别精密吸取2 mL不同浓度的大蝎子草水溶性总黄酮提取液和VC溶液，置于具塞试管中，再分别加入2 mL DPPH溶液，暗处避光反应30 min，离心取上清液，以无水乙醇进行调零，于517 nm处测吸光度值，根据公式(2)计算清除率，并计算半数抑制率IC50值[9]。

DPPH清除率公式：

(2)

式(2)中：A0为2 mL蒸馏水+2 mL DPPH溶液的吸光度值；A1为2 mL样品+2 mL DPPH溶液的吸光度值；A2为2 mL样品+2 mL无水乙醇溶液的吸光度值。

2.6.2 ABTS自由基清除能力测定

参照柴美灵等[10]的方法，精密配置7 mmol/L的ABTS溶液和2.5 mmol/L的过硫酸钾溶液，分别精密吸取5 mL室温下混合，避光反应12～16 h，即得ABTS工作液，使用前以无水乙醇进行稀释，使其在734 nm下吸光度值为0.7±0.02。分别精密吸取0.3 mL不同浓度的大蝎子草水溶性总黄酮提取液和VC溶液，置于具塞试管中，再分别加入2.7 mL稀释后的ABTS溶液，暗处避光反应30 min，离心取上清液，以无水乙醇进行调零，于734 nm处测吸光度值，根据公式计算清除率，并计算半数抑制率IC50值。ABTS清除率公式如式(2)。式中：A0为0.3 mL蒸馏水+2.7 mL ABTS溶液的吸光度值；A1为0.3 mL样品+2.7 mL ABTS溶液的吸光度值；A2为0.3 mL样品+2.7 mL无水乙醇溶液的吸光度值。

3 结果与分析

3.1 标准曲线的绘制

本实验建立的芹菜素标准曲线，所得曲线方程y=0.06653x+0.02387，R2=0.99948，说明芹菜素在1.92960～11.57760 μg/mL范围内线性关系良好，本实验可根据此方程来计算大蝎子草中水溶性总黄酮的含量。

3.2 单因素试验结果

3.2.1 浸泡时间对水溶性总黄酮得率的影响

如图1所示，浸泡时间在30 min～60 min内，大蝎子草水溶性总黄酮得率随着浸泡时间的增加缓慢提高，在60 min时，黄酮得率达到最大值0.54%，随着浸泡时间继续增大，水溶性总黄酮得率稍有降低，曲线趋于平缓，因此，浸泡60 min为最佳浸泡时间。

3.2.2 料液比对水溶性总黄酮得率的影响

如图2，料液比在1∶10 g/mL～1∶18 g/mL之间时，大蝎子草水溶性总黄酮得率呈递增趋势，当料液比为1∶18 g/mL时，大蝎子草水溶性总黄酮得率达到最大0.55%，继续加大料液比，总黄酮得率下降，因此，最佳料液比为1∶18 g/mL。

图1 浸泡时间对大蝎子草水溶性总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of soaking time on the yield of water-soluble total flavonoids in Girardinia diversifolia

图2 料液比对大蝎子草水溶性总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of water-soluble total flavonoids in Girardinia diversifolia

3.2.3 提取时间对水溶性总黄酮得率的影响

如图3所示，提取时间在30 min～60 min时，大蝎子草水溶性总黄酮得率呈上升趋势，当提取时间为60 min时，大蝎子草水溶性总黄酮得率达到峰值0.56%，随着提取时间的增加，水溶性总黄酮得率下降并逐渐趋于平缓，因此，最佳提取时间为60 min。

图3 提取时间对大蝎子草水溶性总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the yield of water-soluble total flavonoids in Girardinia diversifolia

3.3 响应面优化结果与分析

根据单因素试验结果，设计Box-Behnken试验，方案及结果如表2所示。

采用Design-Expert8.0.6软件对表2的试验数据进行响应面回归拟合，得到水溶性总黄酮含量响应值(Y)和各变量(A、B、C)之间的二次回归模型为：Y=5.24+0.14A+0.17B+0.30C+0.16AB-0.17AC-0.074BC-0.32A2-0.50B2-0.40C2。

表2 Box-Behnken试验设计和结果Tab.2 Design and results of Box-Behnken experiment

对该方程的回归分析和方差分析如表3所示。

表3 方差分析结果Tab.3 Results of variance analysis

由表3可知，二次多项式拟合模型极显著(P=0.0037<0.01)，失拟项不显著(P=0.2916>0.05)，F值为9.37，表明此模型极显著，即各因素与其响应值之间有着极为显著的相关性。R2=0.9234，R2Adj=0.8249，CV为0.2493%，说明预测值与实际值高度相关，可解释92.34%的水溶性总黄酮含量响应值变化。由此说明，该模型可对大蝎子草水溶性总黄酮含量进行分析和预测。

如表3所示，由P值可知单因素对大蝎子草水溶性总黄酮含量的影响顺序依次为：C(提取时间)>B(料液比)>A(浸泡时间)，一次项C(P<0.01)差异极显著；一次项A和B(P>0.05)不显著；交互项AB、AC和BC(P>0.05)不显著；二次项B2和C2(P<0.01)极显著；A2(P<0.05)显著；表明提取时间对大蝎子草水溶性总黄酮含量具有显著的影响。

为考察各因素之间交互作用对大蝎子草水溶性总黄酮含量影响，通过Design-Expert 8.0.6软件绘制各个因素交互的响应面图。结果如图4所示，交互项响应曲面的坡度越陡峭，且等高线呈椭圆形或马鞍形，说明其交互作用多水溶性总黄酮含量影响较大，根据各交互图可以看出，各交互项对大蝎子草含量的影响顺序为AC>AB>BC。这与表3中回归方程的方差分析结果一致。

图4 各因素交合作用的等高线图和响应面Fig.4 Contour and response surface diagrams of interaction of various factors

3.4 提取条件优化及工艺验证

根据响应面回归模型预测可得大蝎子草水溶性总黄酮的最佳提取工艺参数为浸泡时间65.10 min，料液比1∶18.69 g/mL，提取时间69.81 min。为操作方便，实际操作将其调整为：浸泡时间为65 min，料液比为1∶19 g/mL，提取时间为70 min。进行3批验证试验，测得3批大蝎子草水溶性总黄酮含量分别为6.42 mg/g、6.45 mg/g、6.40 mg/g，RSD=0.3913%，说明该提取工艺稳定可靠。

3.5 大蝎子草水溶性总黄酮抗氧化活性分析

3.5.1 大蝎子草水提液对DPPH自由基清除作用

对3.4项下优化得到的大蝎子草水提液和VC溶液进行DPPH清除试验，试验结果如图5所示，在12.5 μg/mL～100 μg/mL范围内，大蝎子草水提液对DPPH自由基的清除能力呈急剧上升趋势。随着大蝎子草水提液浓度的不断增大，其对DPPH自由基的清除率曲线逐渐趋于平缓，当大蝎子草水提液浓度为300 μg/mL时，其清除率为73.375%，低于VC溶液的清除率97.342%。在12.5 μg/mL～300 μg/mL浓度范围内，大蝎子草水提液对DPPH自由基清除能力明显低于VC。经SPSS22.0软件计算大蝎子草水提液和VC溶液对DPPH自由基的IC50值分别为59.616 μg/mL和0.018 μg/mL。

图5 大蝎子草水提液对DPPH自由基的清除作用Fig.5 Scavenging rate of DPPH radical by water extract of Girardinia diversifolia

3.5.2 大蝎子草水提液对ABTS自由基清除作用

对3.4项下优化得到的大蝎子草水提液和VC溶液进行ABTS清除试验，试验结果如图6所示，在5 μg/mL～50 μg/mL范围内，大蝎子草水提液和VC对ABTS自由基的清除能力均呈急剧上升趋势。随着大蝎子草水提液和VC浓度的不断增大，其对ABTS自由基的清除率曲线逐渐趋于平缓，当浓度为70 μg/mL时，大蝎子草水提液的清除率为99.38%，VC的清除率为99.38063%，经SPSS22.0软件计算大蝎子草水提液和VC对ABTS自由基的IC50值分别为12.086 μg/mL和13 μg/mL，说明大蝎子草水提液对ABTS自由基清除能力略高于VC。

图6 大蝎子草水提液对ABTS自由基的清除作用Fig.6 Scavenging rate of ABTS radical by water extract of Girardinia diversifolia

4 讨论

本实验以水为提取溶剂，分别考察了冷浸、超声和回流3种提取方式，结果显示回流提取所得到的水溶性总黄酮含量较高。在单因素考察中，浸泡60 min时，药材达到最大吸水率，初始阶段可能因为浓度差原因，提取溶液迅速将样品包裹，此时，提取液中水溶性总黄酮含量提高[11]，随着浸泡时间的增加，样品在提取液中逐渐沉降，导致水溶性总黄酮含量降低[12-13]；随着料液比增大，水溶性总黄酮得率呈先升后降趋势，主要原因可能为随着提取溶剂的量的提高，增大了大蝎子草药材与提取溶剂的接触面积 ，促进了水溶性总黄酮的溶出，当提取溶剂的量达到一定时，继续增加料液比，提取率反而下降，可能为水溶性总黄酮类物质已基本溶出，此时若继续增大溶剂，不仅会造成杂质的溶解，还可能由于溶剂比例过大会增加提取过程中水溶性总黄酮的损耗[6]；在提取时间考察中，随着提取时间的增加，总黄酮提取率呈现先增后减的趋势，可能原因为随着提取时间延长，溶剂对溶质的溶胀和渗透作用有助于黄酮类物质向溶剂扩散，从而水溶性总黄酮得率上升，但提取时间过长，大蝎子草中其他物质大量溶出，与黄酮类物质共同竞争溶出，从而导致水溶性总黄酮得率下降[14-15]，

Box-Behnken 响应面法与常用的均匀设计、正交设计、星点设计等方法相比较，其采用多元线性和二次项模型拟合能提高实验精确度并预测最佳点，经过对大蝎子草相关文献的研究，尚未发现对大蝎子草水溶性总黄酮含量进行响应面试验，故本实验采用响应面法优化大蝎子草水溶性总黄酮的提取工艺，并进行DPPH和ABTS自由基清除试验，既填补了文献的空白，又为后续研究提供了基础。