黄连素治疗缺血性脑卒中的作用机制研究进展

陈维萍，苏丹颖

0 引言

缺血性脑卒中(Ischemic stroke，IS)是脑动脉血液突然阻断导致神经功能缺损性疾病。紧急恢复血流是目前最有效的治疗措施，但是，全球范围能接受静脉溶栓的患者不到5%，能接受血管内介入治疗的患者人数不超过十万[1]，绝大多数患者接受的治疗方案为抗血小板、抗凝、调脂、神经保护和康复训练等综合治疗[2]。IS复发率、致残率、死亡率居高不下，因此迫切需要新的治疗策略。黄连素又名小檗碱，是广泛存在于黄连、黄柏、小檗等中草药的天然生物碱，目前临床上应用其盐酸盐作为治疗肠道感染的非处方药，不良反应小[3]。随着研究的深入，发现其具有广泛的药理作用，并已经开展大量治疗疾病的临床随机对照试验，如用于治疗IS、2型糖尿病、多囊卵巢综合征、高脂血症、动脉粥样硬化和癌症等[4]。黄连素口服生物利用度低，这限制了其临床应用，但已经出现许多提高其生物利用度的医药技术[5]。目前已有一些关于黄连素干预IS的研究发现其作用机制复杂，且各研究之间的作用机制存在重复性，因此，需要总结黄连素治疗IS的作用机制。本文将从抑制神经细胞死亡、抗炎症反应、抗氧化应激、促进血管新生、表观遗传修饰、保护血脑屏障等方面对黄连素治疗IS的作用机制进行综述，为进一步的机制研究和临床应用提供思路。

1 抑制神经细胞死亡

神经细胞死亡是IS的重要病理机制，存在于脑血流阻断和血流再灌注之后，是损伤直接破坏或启动胞内死亡程序的结果，存在着多种形式的细胞死亡方式，包括非程序性坏死和程序性细胞死亡，如细胞凋亡、细胞焦亡、铁死亡、坏死性凋亡和自噬依赖性细胞死亡等[6]。坏死无法逆转，而程序性细胞死亡在一定程度上可以逆转，缺血半暗带区主要出现程序性细胞死亡，抑制神经细胞死亡是挽救缺血半暗带区的重要途径。研究发现，黄连素可以抑制IS过程中细胞凋亡和细胞焦亡，黄连素在脑缺血过程中与其他细胞死亡方式的联系可以进一步探究。已有研究发现，黄连素可以抑制小鼠海马神经元HT22细胞的铁死亡[7]，推测在IS情况下，黄连素也有可能抑制铁死亡。

1.1 抑制细胞凋亡 细胞凋亡是最常见的程序性细胞死亡，可通过内源性或外源性途径触发。脑缺血出现的谷氨酸兴奋性毒性、乳酸酸中毒、氧化应激等促进钙离子入胞，介导线粒体上抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)促进凋亡小体形成，进一步激活凋亡执行体半胱氨酸的天冬氨酸特异蛋白水解酶(Cysteine-containing aspartate-specific protease，caspase)-3，最终导致核DNA降解，推动细胞凋亡[8]。Zhao等[9]用黄连素干预大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠，发现黄连素可以改善神经功能缺损程度、降低缺血半暗带区caspase-3水平，即抑制细胞凋亡，可能与黄连素下调CNPY2调控的内质网应激有关。Xie等[10]用黄连素处理氧糖剥夺/复氧(Oxygen-glucose deprivation/re-oxygenation，OGD/R)模型PC12细胞，发现黄连素可以促进细胞存活，降低Bax和cleaved-caspase3，下调内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP，下调自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I比例，表明黄连素可以抑制细胞凋亡，且机制可能与黄连素抑制内质网应激和自噬有关。一些研究发现，黄连素可以通过调控信号通路来上调Bcl-2和下调Bax、caspase-3以抑制细胞凋亡，包括激活PI3K/Akt信号通路、激活AMP活化蛋白激酶(AMP-acitvated protein kinase，AMPK)信号通路、调控MAPK信号通路、激活沉默信息调节因子1(Sirtuin type 1，SIRT1)和抑制缺氧诱导因子1(Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信号通路[11-15]。Chai等[16]进行的小鼠体内、体外实验研究发现，黄连素可以通过抑制调节G0/G1期的细胞周期蛋白D型和p53磷酸化，使得细胞维持在G0/G1，进而促进细胞存活，抑制细胞凋亡。

1.2 抑制细胞焦亡 细胞焦亡的经典途径由caspase-1介导。脑缺血可启动小胶质细胞炎症反应并促使炎症小体的形成，炎症小体招募并激活caspase-1，进而促使白细胞介素(Interleukin，IL)-1β等促炎因子生成，并切割成孔蛋白胃泌素D(Gasdermin D，GSDMD)，从而使得细胞膜上出现孔隙、促炎因子释放，最终导致细胞死亡[17]。Zhao等[18]用黄连素干预OGD/R条件下的大鼠海马神经元细胞，发现黄连素可下调cleaved-caspase-1、GSDMD、IL-1β和上调过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)-γ，且黄连素抗细胞焦亡作用可以被PPAR-γ抑制剂抑制，即黄连素通过上调PPAR-γ表达抑制细胞焦亡。

2 抗炎症反应

抗炎症反应是新的卒中疗法的重要方向[19]。IS后炎症反应表现为血脑屏障破坏、脑水肿、外周血白细胞浸润、小胶质细胞和星形胶质细胞活化，释放大量肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)、IL、炎症趋化因子和潜在的细胞毒性因子，无菌炎症级联启动，加重脑损伤[19]。Zhu等[20]在黄连素干预MCAO小鼠的实验中发现，黄连素可以降低脑水含量、降低血清炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，可能与降低高迁移率族蛋白1、Toll样受体4和核转录因子-κB(Nuclear transcription factor-κB，NF-κB)含量有关。在MCAO大鼠实验中，王博等[11]研究发现，黄连素可以减轻脑组织损伤、降低血清和脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和细胞间黏附分子1水平，这些作用可以被SIRT1抑制剂逆转，表明黄连素可通过激活SIRT1发挥抗炎症作用。在黄连素用于急性缺血性脑卒中(Acute ischemic stroke，AIS)患者的随机对照试验中，也发现黄连素可以改善患者神经功能缺损症状，降低患者血清炎性因子IL-6、C反应蛋白和巨噬细胞移动抑制因子水平[21]。

3 抗氧化应激

氧化应激是机体产生自由基和抗氧化机制消除自由基之间的不平衡状态。自由基主要包括活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、活性氮和脂质过氧化物，如过氧化氢、一氧化氮(Nitric oxide，NO)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)。重要的抗氧化机制包括抗氧化剂和抗氧化酶，如抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、抗氧化剂谷胱甘肽(Glutathione，GSH)[22]。在IS过程中会出现氧化应激，氧化应激会导致神经细胞死亡、炎症反应、血脑屏障破坏、脑水肿、自噬等病理生理事件，进而加重脑损伤[22]。抗氧化应激可以通过抑制氧化系统和增强抗氧化系统实现，如激活核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件信号通路。Shou等[23]进行的体内和体外实验发现黄连素可以降低氧化损伤神经干细胞和MCAO小鼠脑组织的ROS水平，减轻脑梗死体积，使用PPARδ抑制剂可减弱黄连素以上作用。进一步研究发现，黄连素通过激活PPARδ，促进Nrf1、Nrf2和醌氧化还原酶1的表达来清除ROS，从而发挥神经保护作用。杨鲁杰等[24]用黄连素干预MCAO大鼠，发现黄连素可以提高大鼠认知功能、减小梗死体积、增加脑组织SOD含量，减少脑组织NO、eNOS含量，同时p-AMPK/AMPK比值增加，提示黄连素可以通过减轻氧化应激发挥神经保护作用，分子机制可能与提高AMPK磷酸化水平有关。Zhang等[25]同样发现黄连素可以减小MCAO大鼠脑梗死体积，改善神经功能缺损，可能与黄连素降低脑组织氧化剂NO、MDA水平和提高脑组织抗氧化剂SOD、GSH水平有关。柴美静等[26]在黄连素治疗AIS患者的临床试验中，发现常规治疗加用黄连素能更有效地改善神经功能缺损症状、降低血清MDA水平和提高血清谷胱甘肽过氧化物酶水平。

4 促进血管新生

血管新生即为新生血管的形成，由内皮细胞从先前存在的血管中发芽诱导而成，可发生在各种生理和病理条件下[27]。IS发生后，新生血管从正常脑组织延伸至缺血半暗带区，可改善周围缺血区血液灌注，减少脑梗死体积，重塑神经结构，促进中枢神经系统功能恢复。因此，增强血管生成是促进IS后功能恢复的重要策略之一[27]。Zhu等[28]用黄连素干预MCAO小鼠，发现术后第14天，黄连素组血管内皮标志物CD31和细胞增殖标志物Ki67双阳性细胞明显增多、68Ga-NODAGA-RGD PET/CT扫描检测显示黄连素组68Ga-NODAGA-RGD摄取更高，即黄连素组比模型组微血管数量更多，表明黄连素可以促进脑缺血再灌注后脑血管内皮细胞增殖和血管生成重构；进一步机制研究发现，黄连素促进血管生成可能与通过激活AMPK信号通路促进小胶质细胞M2极化有关。Liu等[29]给MCAO大鼠腹腔注射黄连素7 d，发现黄连素组的神经系统评分明显低于MCAO组，微血管密度明显高于模型组，HIF-1和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的转录和表达明显高于模型组，这提示黄连素可以促进脑缺血再灌注损伤大鼠血管生成，机制可能与激活HIF-1/VEGF信号转导通路有关。

5 表观遗传修饰

表观遗传学是指对基因表达的改变而不是遗传密码本身的改变所导致的可遗传的生物体变化的研究，存在多种表观遗传修饰，如DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰和非编码RNA干扰等[30]。研究发现，IS后脑内整体DNA甲基化上调与预后不良相关，DNA甲基化下调对脑缺血具有神经保护作用[31]。Pang等[32]研究发现，氧糖剥夺(Oxygen-glucose deprivation，OGD)处理后的细胞检测到DNA甲基转移酶水平和DNA甲基化水平增加，经过黄连素处理后，OGD条件下DNA甲基转移酶水平和DNA甲基化水平降低；进一步分析发现，黄连素可以抑制PPARγ DNA甲基化，上调PPARγ表达，从而发挥脑缺血再灌注损伤保护作用。Chai等[33]在黄连素干预脑缺血再灌注损伤的体内、体外实验中发现，黄连素可以结合视网膜母细胞瘤1(Retinoblastoma 1，Rb1)mRNA上的poly(A)尾，以拮抗RB1 mRNA的降解，进而稳定Rb蛋白水平，阻滞细胞周期，促进神经细胞在脑缺血损伤中存活。

6 保护血脑屏障

血脑屏障在调节血脑界面液体、溶质、细胞的运输和维持中枢神经系统稳态微环境中起着重要作用，其结构成分包括内皮细胞、紧密连接、周细胞、星形胶质细胞终足和细胞外基质[34]。IS发生后，血脑屏障被破坏，血源性细胞、化学物质和液体通过受损的血脑屏障外渗到脑实质，大脑的水、离子稳态失衡会导致脑水肿，白细胞浸润会促进炎症反应，加重脑损伤[34]。崔洪雨等[35]在黄连素治疗MCAO大鼠的研究中发现，黄连素可以改善大鼠神经行为障碍、降低脑组织水肿程度、降低脑组织水通道蛋白4(Aquaporin-4，AQP4)表达，这提示黄连素可以改善脑缺血后脑水肿，机制与降低AQP4水平有关。王美华等[36]用黄连素干预OGD/R条件下培养的大鼠脑微血管内皮细胞，发现黄连素可以提高细胞存活率、增加细胞紧密连接蛋白ZO-1、occludin表达量，降低TNF-α和IL-1β含量并抑制NF-κB入核，表明黄连素对缺氧缺血损伤下的脑微血管内皮细胞具有保护作用，机制可能与抗炎有关。

7 其他

有研究发现，黄连素抗IS的机制与抑制兴奋性毒性和抑制自噬有关。兴奋性毒性是由谷氨酸介导的神经毒性，脑缺血导致谷氨酸大量释放，从而刺激谷氨酸受体，诱导钙离子内流，受体下游钙依赖性激活的死亡信号蛋白触发大量的信号级联，进而诱导神经元死亡[37]。Nadjafi等[38]用OLN-93细胞建立OGD/R模型，发现黄连素和谷氨酸受体拮抗均能提高细胞活性，降低胞内钙离子水平，这表明黄连素可以抑制胞内钙离子超载，降低兴奋性毒性，发挥缺血条件下神经保护作用。自噬是一种自我吞噬的细胞分解代谢途径，对维持细胞内稳态和正常的细胞功能具有重要作用[39]。自噬在IS中起着双刃剑作用，一方面，减轻细胞器损伤的影响，维持细胞内稳态，另一方面，过度或长时间的自噬会导致自噬溶酶体积累，最终导致细胞功能障碍、细胞死亡[39]。丁实等[40]通过建立大鼠MCAO模型，研究黄连素在脑缺血再灌注损伤中的作用机制，发现黄连素干预组可以降低Beclin-1蛋白表达和LC3-II/LC3-I比值、增加p62蛋白表达，这种作用可以被Bcl-2抑制剂削弱；进一步分析发现，机制可能是黄连素增强Bcl-2与Beclin-1结合。

8 总结与展望

综上所述，黄连素对IS的治疗作用被大量动物、细胞实验和临床试验所证实，且其作用机制呈现多靶点、多通路、多方位的特点。目前，基于脑缺血动物细胞模型研究，发现黄连素抗IS作用机制集中在抑制神经细胞死亡、抗炎症反应、抗氧化应激、促进血管新生、表观遗传修饰、保护血脑屏障等方面，临床研究也证实黄连素可通过抗炎症反应和抗氧化应激改善IS患者神经功能缺损症状。尽管黄连素治疗IS作用机制研究较多，但其存在一些不足之处：首先，研究涉及的观察指标及信号通路较单一，各研究范围较局限，针对多靶点、多信号通路之间关联性的研究甚少；其次，IS的发病机制复杂多样,且新的机制也在不断被发现，目前的作用机制研究仅涉及到部分IS病理机制过程，还有其他更多的潜在作用机制尚需探索；此外，黄连素治疗IS的临床研究多属小样本、单中心、未实施盲法，且实验设计缺乏科学性，导致临床研究质量不高，研究结论可重复性和可靠性差。针对以上问题，未来的研究可以增加黄连素抗IS作用靶点或信号通路上下游关系探索，增加设计黄连素对多条信号通路之间串扰的研究，更深入地探讨作用机制之间的相互关系。此外，还可利用数据挖掘、网络药理学、代谢组学等新兴学科探讨黄连素治疗IS多靶点、多通路、多环节协同作用关系。此外，重视药理研究的临床转化，不仅需要进行黄连素治疗IS患者的研究，而且需要开展大样本、双盲、多中心的临床随机对照试验研究，进而为明确黄连素治疗IS临床疗效和安全性提供可靠的证据。未来可以进一步探索黄连素抗IS潜在的机制，如脑-肠轴调节、细胞能量代谢调节和抗血小板凝集等。黄连素除了靶向IS的病理生理机制，对IS发病危险因素，如高血压、糖尿病、高脂血症、动脉粥样硬化和肥胖均有药理活性，未来可以进一步研究黄连素对IS的预防作用及机制。总之，黄连素是一种治疗IS极具潜力的药物，其抗IS药理作用机制和临床疗效值得进一步研究。