血清环状FoxO3a在宫颈鳞癌患者中的 表达及其临床意义

陈 婷

（张家港市第一人民医院妇产科，江苏 苏州 215600）

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，其早期症状主要是局限于宫颈，还没有向周围其他组织蔓延，因此患者往往没有明显症状，随着肿瘤的增大，压迫和侵犯临近器官组织才会出现相应症状，并严重威胁女性的健康和生命。宫颈癌病理类型有鳞状细胞癌、腺癌等，以宫颈鳞状细胞癌（squamous cervical cancer， SCC）最为常见[1]。宫颈癌的早期筛查，可以及时发现癌变细胞并进行治疗，能够提高患者预后效果。鳞状细胞癌抗原（SCC-Ag）是目前最常用的鳞状细胞癌标志物，在肺癌、食管癌及头颈部肿瘤中被证实可用于评估肿瘤的恶性程度，预测患者的生存预后，但是SCC-Ag的特异性较差[2]，因此迫切需要探索新的无创血清生物标志物，以更准确地预测SCC患者的预后。非编码RNA是真核生物体内广泛存在的一类能够调控遗传物质正常转录和翻译表达的小分子物质，在多种疾病包括恶性肿瘤、心脑血管疾病及正常组织发育和分化过程中扮演重要角色。圆形叉头盒O3a（FoxO3a）被证实是一种重要的肿瘤抑制因子，在多种恶性肿瘤组织中表达下调，并且参与细胞增殖和细胞周期；同时，也有研究表示FoxO3a可以作为非小细胞肺癌患者的早期诊断、治疗监测及预后的标志物[3-4]。本研究旨在探讨SCC患者血清环状FoxO3a与肿瘤病理特征的关系，及其对预测患者预后的应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2018年5月至2020年5月张家港市第一人民医院收治的98例SCC患者（SCC组）的临床资料，另回顾性分析30例宫颈上皮内瘤变患者（瘤变组）和30例健康体检志愿者（健康组）的临床资料。其中健康组研究对象年龄45～74岁，平均（56.5±7.1）岁；瘤变组患者年龄46～73岁，平均（55.8±6.7）岁；SCC组患者年龄44～76岁，平均（57.6±7.3）岁。3组研究对象年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），组间具有可比性。纳入标准：SCC组患者符合《宫颈癌及癌前病变规范化诊疗指南（试行）》[5]中的相关诊断标准，宫颈活检及术后病理诊断为宫颈鳞状细胞癌；瘤变组患者符合《妇产科学》[6]中的相关诊断标准；术前无放化疗及其他干预性治疗者；患者临床资料完整等。排除标准：入组前6个月内存在宫颈病变并接受过治疗者；合并其他部位原发恶性肿瘤者；严重肝、肾功能障碍或自身免疫性疾病者等。本研究经过院内医学伦理委员会批准。

1.2 研究方法 ①采集所有研究对象外周静脉血10 mL于抗凝管中，根据检测试剂盒（美国Invitrogen公司）提示步骤依次完成血清分离、冷冻、复苏及提纯等，采用超微量分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司，型号：Nano-Drop-2000）测定核糖核酸（RNA）浓度。收集RNA（2 µg）在37 °C和3 U/µg RNase R（上海震中生物技术有限公司）孵育15 min去除线性RNA，纯化环状FoxO3a；然后使用实时荧光定量PCR系统（美国赛默飞世尔abi公司，型号：7500 Fast Real-Time PCR）和SYBR Green荧光定量PCR试剂盒（中国大连Takara有限公司）进行逆转录定量PCR（RT-qPCR）。引物购自中国上海桑光生物科技有限公司，序列为：FoxO3a（F）5'-ATTGCCAGAGAGGCCGCGCGG-3'，（R）5'-GTGGAACTGGTGCTAG-3'；GAPDH（F）5'-GTCTCCTGTCAGCGCGCGAG-3'，（R）5'-ACCCTTGTCAGCA-3'。根据扩增试剂盒提示配置恰当的反应体系和设置扩增参数，结束后电泳进行产物鉴定。以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt法计算FoxO3a的相对表达量。②采用受试者工作特征（ROC）曲线分析FoxO3a对SCC患者预后的诊断价值。③以ROC曲线最佳截断值0.23为临界值，将患者划分为高FoxO3a组（58例，FoxO3a≥ 0.23）与低FoxO3a组（40例，FoxO3a＜0.23），对比分析高FoxO3a组和低FoxO3a组患者的临床资料。临床资料主要包括年龄（＜58岁、≥ 58岁）、TNM分期（Ⅰ ～ Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ期）、肿瘤直径（≤ 4 cm、＞4 cm）、淋巴血管侵犯（阴性、阳性）、间质浸润深度（＜1/2、≥ 1/2）、淋巴结转移（阴性、阳性）。④所有患者均进行随访追踪至死亡日期或术后5.0～26.0个月，随访方式为电话或门诊，频率为1次/3个月，记录患者术后的生存情况，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并行Log-rank检验进行生存分析。⑤采用Cox比例风险模型分析影响SCC患者术后预后的相关因素。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件分析数据，计量资料均符合正态分布且方差齐，以(±s)表示，行t检验；计数资料以[例(%)]表示，采用χ2检验；采用ROC曲线分析FoxO3a对SCC患者术后预后的诊断价值；采用Kaplan-Meier绘制生存曲线，行Log-rankχ2检验；采用Cox比例风险模型分析影响SCC患者术后预后的相关因素。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组研究对象血清FoxO3a相对表达量比较 健康组、瘤变组、SCC组研究对象FoxO3a相对表达量分别为（0.89±0.09）、（0.90±0.11）、（0.44±0.08），SCC组显著低于健康组、瘤变组，差异均有统计学意义（t=26.170、25.104，均P＜0.05），但健康组、瘤变组研究对象血清FoxO3a相对表达量比较，差异无统计学意义（t=0.385，P＞0.05）。

2.2 FoxO3a预测SCC患者预后的ROC曲线 所有患者随访5.0～26.0个月，中位时间18.5个月，随访期间SCC组患者中死亡10例，死亡率为10.2%（10/98）；ROC曲线分析显示，FoxO3a预测SCC患者预后的AUC值为0.856（95%CI：0.798～0.899），差异有统计学意义（P＜0.05），敏感度为81.20%，特异性为73.60%，最佳截断值为0.23，见图1。死亡患者、生存患者血清FoxO3a相对表达量分别为（0.18±0.02）、（0.62±0.11），死亡患者血清FoxO3a相对表达量显著低于生存患者，差异有统计学意义（t=12.570，P＜0.05）。

图1 FoxO3a预测SCC患者预后的ROC曲线

2.3 高FoxO3a组和低FoxO3a组患者临床资料比较 低FoxO3a组中Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤直径＞4 cm、淋巴血管侵犯阳性、间质浸润深度≥ 1/2、淋巴结转移阳性的患者占比均显著高于高FoxO3a组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 高FoxO3a组和低FoxO3a组患者 临床资料比较[例(%)]

2.4 高FoxO3a组和低FoxO3a组患者Kaplan-Meier生存曲线分析 低FoxO3a组累积生存率显著低于高FoxO3a组，差异有统计学意义（Log-rankχ2=5.659，P＜0.05），见图2。

图2 高FoxO3a组和低FoxO3a组患者 Kaplan-Meier生存曲线图

2.5 影响SCC患者预后的Cox比例风险模型分析 单因素和多因素Cox分析结果显示，淋巴血管侵犯阳性、间质浸润深度≥ 1/2、淋巴结转移阳性、FoxO3a＜0.23均是影响SCC患者预后的危险因素，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 影响SCC患者预后的Cox比例风险模型分析

3 讨论

SCC是宫颈癌的一种病理类型，肿瘤来源于宫颈鳞状上皮细胞，如果肿瘤分化程度比较低，可以看到角化珠和组织间桥的话，则异型性比较低，细胞的倍增时间也比较长，发展速度也就相对慢一些。宫颈癌鳞癌的患者需要接受以手术治疗为主、放化疗为辅助的综合性治疗，手术切除范围需要根据肿瘤的大小和侵犯范围来决定，晚期患者预后较差，因此早期发现并进行治疗，预后效果更好。

环状RNA是新近发现的一种非编码RNA，可通过miRNA海绵样效应或与蛋白相互作用在乳腺癌、肝细胞癌、结直肠癌、肺癌等多种恶性肿瘤的发生和侵袭转移过程中发挥重要作用[7-8]。FoxO3是著名的转录因子家族成员，通常以抑癌作用为主，肿瘤组织高表达FoxO3a患者预后通常较好[9]。本研究结果发现，SCC组患者血清FoxO3a相对表达量显著低于健康组、瘤变组，SCC组中死亡患者血清FoxO3a相对表达量显著低于生存患者，提示SCC患者血清FoxO3a相对表达量同样呈现低表达，并且死亡患者表达更低。TIAN等[10]研究指出，低表达FOXO3a与宫颈癌预后不良相关，并通过WNT/β-catenin信号通路促进细胞侵袭和迁移等行为。本研究中，ROC曲线分析显示，FoxO3a预测SCC患者预后的AUC值为0.856，敏感度为81.20%，特异性为73.60%，最佳截断值为0.23；低FoxO3a组中Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤直径＞4 cm、淋巴血管侵犯阳性、间质浸润深度≥ 1/2、淋巴结转移阳性的患者占比均显著高于高FoxO3a组，提示FoxO3a相对表达量与SCC患者预后密切相关。FoxO3a是FOXM1转录因子的上游调节基因，也是磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路的重要下游效应物，FOXM1/FoxO3a信号通路可以通过调节肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、血管生成来控制恶性肿瘤的严重程度，也可影响肿瘤的病理 特征[11]。

本研究中，单因素和多因素Cox分析结果显示，淋巴血管侵犯阳性、间质浸润深度≥ 1/2、淋巴结转移阳性、FoxO3a＜0.23均是影响SCC患者预后的危险因素，可见FoxO3a＜0.23与SCC患者预后不良密切相关。无论是肿瘤TNM分期升高、肿瘤直径增大、淋巴血管侵犯阳性、间质浸润深度增加，还是淋巴结转移阳性均提示肿瘤恶性程度较高，均出现血清FoxO3a相对表达量降低，也说明FoxO3a表达下调后释放入血浓度降低，发挥抑癌效应减弱，进而出现肿瘤恶性侵袭。FOXO3a是一种重要的蛋白质转录调节因子，广泛参与多种生物学过程，包括增殖、细胞周期调节、存活、凋亡及自噬等，同时还与氧化应激、DNA损伤相关[12]。FOXO3a是PI3K/AKT信号通路的重要下游信号传导分子之一，当PI3K/AKT信号通路被激活时，AKT被磷酸化，活化的AKT可使其下游信号传导分子FOXO3a的3个磷酸化位点被磷酸化，磷酸化的FOXO3a转录因子与胞核内结构蛋白特异性结合，使FOXO3a从细胞核内移入细胞质中，抑制FOXO3a的转录活性，从而促进肿瘤细胞增殖、分化，加重SCC患者病情，不利于预后 恢复[13]。

综上，术前FoxO3a相对表达量与SCC患者术后预后密切相关，其对SCC患者术后预后评估亦具有较高的预测价值，且淋巴血管侵犯阳性、间质浸润深度≥ 1/2、淋巴结转移阳性、FoxO3a＜0.23均是SCC患者术后预后不良的危险因素。但研究不足是样本量较小，随访时间较短，可能出现选择性偏倚和统计误差。