复垦土壤净氮矿化、硝化速率及氮相关酶活性对不同有机肥的响应

杨杰，郝鲜俊，张若扬，李 媛，高文俊，张杰

（1.山西农业大学 资源环境学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 农业资源与环境国家级实验教学示范中心，山西 太谷 030801；3.山西农业大学 草业学院，山西 太谷 030801）

山西省作为我国重要的煤炭能源基地，在煤炭开采过程中，造成了土地资源破坏和侵占等一系列问题，其中以采煤引起的大面积土地塌陷最为突出。截至2020年底，山西省有2 429 km2矿山发生塌陷[1]。采煤塌陷导致土壤结构与理化性质等发生改变，也加速了耕地面积锐减。党的第十九届五中全会中明确提出，坚守18亿亩（1.2亿hm2）耕地红线，确保耕地数量的同时提高质量[2]。因此，加大采煤塌陷地土壤的复垦力度，增加耕地后备资源十分必要。采煤塌陷地治理的第一步多为工程复垦，在此过程中，由于机械碾压和底土上翻造成了土壤结构和层次的破坏，致使耕层土壤养分匮乏。相关研究表明，矿区复垦土壤的生态恢复必须将工程复垦和生物复垦有机结合，才能实现生态环境的可持续发展[3]。

氮作为影响作物生长发育的关键营养物质，可以提高作物的产量和品质，因此，农民经常大量施用化学氮肥，但长期大量施用化学氮肥，不仅使土壤理化性质恶化，而且在灌溉和降水过程中，还会通过地表径流或淋移进入地下水，造成地下水污染[4-6]。为了促进绿色农业的发展，2021年中央一号文件中提出，化肥减量增效，加强畜禽粪污资源化利用[2]。与此同时，随着畜禽养殖的规模化发展，仅2017年我国畜禽粪尿产量就达到了4×109t左右，其中，含氮2.1×107t[7]。因此，在煤矿复垦土壤上合理施用有机肥，既可提高土壤氮素含量，又能改善土壤理化性质，达到作物稳产高产目的同时，还能实现畜禽粪肥的资源化利用。有机肥作为土壤有机氮的主要来源，尽管当季利用率低于化肥氮，但在培肥地力方面效果显著[8-10]。有机肥中的氮素大多为有机态，作物利用率低，可被作物直接吸收的矿质氮含量极少，需要通过矿化作用将有机氮转化成矿质氮[11-12]。郭校伟等[13]、娄燕宏等[14]、梁韵等[15]的研究均发现，单施鸡粪或猪粪与不施肥或单施化肥处理相比，提高了土壤矿质氮含量。土壤酶作为一种生物活性物质，具有生物化学催化能力，参与土壤中许多重要的生化过程，对氮素的矿化也有促进作用，特别是脲酶、蛋白酶等对氮素有专性的土壤酶类[16-17]。有机肥施入土壤后，影响了土壤中酶活性，同时在土壤酶的催化下，有机肥中的有机氮矿化为可供作物吸收利用的矿质氮[5-6]。前人研究表明，施用有机肥能显著提高土壤脲酶、天冬酰胺酶、蛋白酶等酶活性[10,18-22]。目前，关于有机肥对土壤氮素矿化及酶活性影响的报道多集中于土壤肥力较高、水热资源丰富的地区[8-10,19-20,23-25]，但在采煤塌陷复垦土壤方面的研究较少，且为数不多的研究在施肥时多是根据农民习惯或基于当地推荐施肥量进行的粗放施肥，而忽视了有机肥中全氮的含量，并以施单一有机肥为主[5,21,26-27]。在同一氮肥水平下，施用不同有机肥对土壤氮素矿化及相关酶活性影响的研究还相对较少。

本试验在同一施氮水平下，通过室内培养，分析化肥、鸡粪、猪粪和牛粪对煤矿复垦土壤氮素矿化特征及氮转化相关酶活性的影响，以期为合理施肥、改善复垦土壤氮素供应状况提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

研究区位于山西省孝义市偏城村的水峪煤矿采煤塌陷区（东经111°37′，北纬37°06′），年平均气温为12.5 ℃，属温带大陆性季风气候，年平均降水量为428.8 mm。该试验区在2015年塌陷稳定后，于2016年采用装载机混推工程复垦，2017年进行定位培肥试验。2018年采集0～20 cm表层土壤，本研究土壤采自培肥试验中施用鸡粪的小区，但未种植作物，去除异物后，常温（25 ℃）风干、混匀过2 mm筛备用。供试土壤类型为褐土，质地为壤质黏土，2018年土壤基本理化性质为：全氮0.7 g/kg，硝态氮10.9 mg/kg，铵态氮27.0 mg/kg，有效磷22.3 mg/kg，速效钾114.6 mg/kg，有机质7.6 g/kg，pH值8.0。

1.2 试验材料

供试有机肥基本理化性质如表1所示。

表1 供试有机肥基本理化性质Tab.1 Basic physicochemical properties of tested organic fertilizers

供试猪粪、鸡粪、牛粪均采自山西农业大学牧 站附近畜禽养殖场的腐熟有机肥，其基本理化性质如表1所示。供试化学氮肥为尿素（N 46%）。

1.3 试验设计

试 验 于2018年9月30日 至2019年2月3日 在山西农业大学资源环境学院微生物实验室进行。试验共设5个处理，分别为：不施肥空白对照、单施化肥、单施鸡粪、单施猪粪、单施牛粪，每个处理3次重复。采用室内好气培养法，称已处理好的供试土壤500 g，装入棕色广口玻璃培养瓶中，使土壤含水量为田间持水量的50%，用塑料膜封住瓶口，于（25±2）℃下先预培养7 d。预培养结束后，将化肥和有机肥按不同施肥处理以300 mg/kg氮（以全N计）折算后分别施入，放置于（30±2）℃培养箱中进行培养，每天开盖通气1 h，每隔3 d用称质量补水法补充水分。具体方法参照山西农业大学资源环境学院矿区土壤复垦团队前期试验[28]。分别于施肥培养后的第0、3、7、14、28、42、56、77、98、126天进行采样，测定土壤含水量、铵态氮含量、硝态氮含量。综合考虑培养天数和采样次数，以不影响后续培养试验为前提，分别取培养前、中、后期（第3、56、98天）的鲜土，测定土壤氮素矿化相关酶活性（脲酶、蛋白酶、天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶），探究不同有机肥和化肥在土壤氮素矿化和硝化过程中对相关酶活性的影响。

1.4 测定项目及方法

土壤全氮、有效磷、速效钾、pH值、有机质和含水量采用《土壤农化分析》[29]中的方法测定，土壤铵态氮、硝态氮含量采用1 mol/L氯化钾浸提过滤后，用连续流动分析仪（SEAL，AA3，德国）进行测定。有机肥基本理化性质根据NY 525—2012《有机肥料》测定。土壤酶活性参照《土壤酶及其研究法》[17]进行测定。

不同有机肥对复垦土壤净氮矿化、净硝化速率的影响分别用公式（1）和（2）计算。

其中，NNmin为净氮矿化速率（mg/（kg·d）），NNnitri为净硝化速率（mg/（kg·d）），t为培养时间（0～126 d）；[NH4+]0和[NH4+]t分别是土壤中铵态氮起始浓度和培养t天的浓度（mg/kg）；[NO3-]0和[NO3-]t分别是土壤中硝态氮起始浓度和培养t天的浓度（mg/kg）。

1.5 数据分析

试验数据采用Microsoft Excel 2016进行前期处理，使用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行分析，对不同施肥处理在培养0～126 d同一采样时期的各参数进行单因素方差分析（Duncan多重比较），对不同处理土壤铵态氮含量、硝态氮含量、净氮矿化速率、净硝化速率与不同酶活性之间进行偏相关性分析，统计显著性水平均为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对煤矿复垦土壤氮素的影响

不同处理土壤铵态氮、硝态氮含量随培养时间变化情况如图1所示。

图1 不同处理土壤铵态氮、硝态氮含量随培养时间变化情况Fig.1 Changes of soil ammonium nitrogen and nitrate nitrogen content with incubation time under different treatments

由图1可知，不施肥空白对照的土壤铵态氮、硝态氮含量在培养期间一直稳定在较低水平，分别为11.0、70.0 mg/kg。与空白对照相比，施肥处理显著提高了土壤铵态氮含量，并且随培养时间的增加铵态氮含量呈下降趋势，至28 d时下降至最低水平，降幅表现为：化肥＞鸡粪＞猪粪＞牛粪。培养28～126 d，施肥处理土壤铵态氮含量保持稳定，并与空白对照间差异不显著。与铵态氮变化趋势相反，施肥处理土壤硝态氮含量随培养时间的延长呈增加趋势，增加速率的大小为化肥＞鸡粪＞猪粪＞牛粪（0～14 d）。14～126 d，施肥处理的土壤硝态氮含量缓慢增加，至培养结束（126 d）时，各处理土壤硝态氮含量依次为：化肥＞鸡粪＞猪粪＞牛粪＞空白，且各处理间差异显著（P＜0.05）。

2.2 不同施肥处理对煤矿复垦土壤净矿化、硝化速率变化的影响

为进一步反映单位时间内土壤硝态氮含量，本试验采用净硝化速率表征土壤硝化强度随培养时间的动态变化，如图2所示。不施肥处理土壤净硝化速率在培养过程中始终维持在较低水平，化肥、鸡粪、猪粪处理的土壤净硝化速率在培养初期较高，随培养时间的延长呈下降趋势，培养后期（98～126 d）维持在较低水平并与空白对照间无显著差异。而牛粪处理在整个培养过程中与空白对照间差异不显著，且其土壤净硝化速率在3～7 d为负值，14～126 d为正值。

土壤净氮矿化速率是指单位时间内土壤有机氮经矿化作用转化为铵态氮、硝态氮的量，它在一定程度上决定了土壤中用于植物生长的氮素有效性[30]。总体来看，各处理土壤净氮矿化速率变化趋势与土壤净硝化速率相似，说明土壤氮素矿化速率受硝化作用影响。化肥、鸡粪和猪粪处理的土壤净氮矿化速率在培养初期（3～56 d）呈下降趋势，而牛粪处理呈上升趋势，随培养时间的延长，各处理净氮矿化速率趋于稳定。各有机肥处理平均土壤净氮矿化速率表现为：鸡粪＞猪粪＞牛粪（图2）。

图2 不同处理土壤净氮矿化、硝化速率动态变化Fig.2 Dynamic changes of soil net nitrogen mineralization/nitrification rates under different treatments

2.3 不同施肥处理对煤矿复垦土壤氮素矿化相关酶活性的影响

脲酶可以酶促尿素产生氨（植物氮源之一）[17]，各处理土壤脲酶活性的动态变化如图3所示。在培养过程中，化肥处理和空白对照的土壤脲酶活性均较低，二者间差异不显著，有机肥处理的脲酶活性显著高于化肥处理，各有机肥处理脲酶活性表现为：猪粪＞鸡粪≥牛粪（P＜0.05）。

图3 不同处理土壤氮素矿化相关酶活性动态变化Fig.3 Dynamic changes of soil nitrogen mineralization related enzyme activities under different treatments

蛋白酶可以催化蛋白质和多肽水解为寡肽和氨基酸[31]。由图3可知，不施肥处理的蛋白酶活性在测定的3个时期均较低，施肥后蛋白酶活性显著提高59.5%～237.3%。在培养3～56 d，各处理蛋白酶活性基本维持稳定，56～98 d逐渐升高。培养98 d时，鸡粪、牛粪和猪粪处理与空白对照相比，蛋白酶活性显著提高了165.0%～237.3%（P＜0.05）。

酰胺酶可以破坏肽和氨基酸的C-N键，从而释放氨[32]。各处理土壤天冬酰胺酶活性变化趋势与土壤铵态氮含量大致相同，均表现为先下降后趋于稳定（图3）。培养过程中，有机肥处理天冬酰胺酶活性显著高于空白对照（P＜0.05）。

由图3可知，空白对照土壤谷氨酰胺酶活性随着培养时间延长逐渐升高，不同有机肥处理均呈先降低后升高趋势，化肥处理则是缓慢降低，并在培养后期（98 d）显著低于有机肥和空白对照（P＜0.05）。培养过程中，各有机肥处理土壤谷氨酰胺酶活性与空白对照间差异不显著。

2.4 复垦土壤氮素及氮素矿化与相关酶活性的相关性分析

为进一步研究土壤酶活性与净氮矿化、硝化速率之间的相关关系，将不同施肥处理作为控制变量进行偏相关性分析，结果表明（表2），蛋白酶与土壤硝态氮含量呈显著正相关，相关系数达0.03。天冬酰胺酶活性与土壤铵态氮、净氮矿化和净硝化速率呈极显著相关，相关系数均＜0.001，说明天冬酰胺酶活性与土壤氮素转化密切相关。脲酶和谷氨酰胺酶活性与铵态氮、硝态氮、净氮矿化、硝化速率无显著相关。

表2 不同施肥处理土壤氮素及净氮矿化、硝化速率与土壤酶活性间的相关系数Tab.2 Correlation coefficients between soil nitrogen and net nitrogen mineralization/nitrification rates and soil enzyme activities under different fertilization treatments

3 讨论

3.1 施肥对复垦土壤氮素矿化的影响

矿质氮作为影响作物生长的重要营养物质，很大程度上也决定了土壤的供氮能力[11,33]。本试验中，随着培养时间的延长，不施肥处理土壤铵态氮和硝态氮含量保持在较低水平，而各施肥处理土壤铵态氮含量逐渐降低，硝态氮含量逐步提高，表明施肥后土壤铵态氮向硝态氮转化，转化的速率从大到小排序为：化肥＞鸡粪＞猪粪＞牛粪，说明化肥的硝化速率高于有机肥，其净硝化速率也显著高于有机肥处理。这是由于本研究选用的化肥为尿素，尿素作为易分解的有机化合物，施入土壤后在脲酶作用下可快速水解为铵态氮，减少了异养硝化微生物对铵态氮的固持并激发了硝化微生物活性，提高了土壤中氮素的矿化速率，增加了氮素矿化量[12]。而在相同施氮水平下，伴随有机肥施入土壤的有机碳含量增加，土壤微生物生长繁殖得到了所需碳源的同时固定了土壤中铵态氮以维持代谢，导致硝化作用底物减少，硝化速率也随之降低[34-35]。本试验培养中后期（28～126 d），各施肥处理土壤铵态氮、硝态氮含量趋于稳定，这是由于随着土壤中易分解的有机氮和能源物质在硝化过程中被逐渐耗尽，微生物活性降低，导致铵态氮释放量也随之减少[36]，同时王敬等[37]研究发现，自养硝化细菌与异养微生物竞争时处于劣势，以上均可能使得土壤净硝化速率在培养过程中呈降低趋势，导致培养后期各处理土壤硝态氮含量趋于稳定[14]。李玲玲[34]和刘春艳[36]也得到了类似的研究结果。

本试验中，不同有机肥处理土壤铵态氮、硝态氮含量以及土壤净氮矿化、硝化速率均表现为：鸡粪＞猪粪＞牛粪，这与张若扬等[28]的研究结果相似，可能与有机肥的C/N有关。本研究中鸡粪、猪粪和牛粪的C/N分别为10.6、12.5、19.7。李玲玲等[12]、CALDERÓN等[38]、龚雪蛟等[39]研究发现，当有机肥C/N＜15时，有机肥氮素矿化速率与C/N呈显著负相关；当C/N＞19.0时，会出现氮素净固定。说明牛粪与鸡粪和猪粪相比更容易发生氮的固定。这是因为鸡和猪饲料中多添加精饲料，其中蛋白质、脂肪含量较高，而牛饲料中粗饲料占比高，并以干草和秸秆含量较多。本试验初期（3～7 d），牛粪处理土壤的净氮矿化、硝化速率为负值，而培养中后期（28～126 d）为正值，说明在培养初期有机氮的矿化作用较弱，以土壤氮固持为主。李平等[40]研究认为，牛粪较高的C/N会使土壤中的微生物在生长繁殖过程中对氮素需求强烈，导致硝化作用底物（铵态氮）不足，使得培养前期土壤中矿质氮的生物固持作用大于有机氮的矿化作用。随着微生物对牛粪中能源物质（主要为碳源）的消耗，土壤对氮素的生物固持作用逐渐减弱，硝化作用底物增加，硝化速率和硝态氮含量随之升高，在培养中后期逐渐表现为氮素的净矿化和净硝化[41]。

3.2 施肥后采煤塌陷区土壤的酶活性及其与土壤氮素矿化的相关性

在土壤氮素循环过程中，脲酶、蛋白酶、天冬酰胺酶和谷氨酰胺酶起重要作用，它们的酶促产物为植物氮源之一，酶活性的强弱可以作为评价土壤肥力的指标[17,42]。其中，脲酶属于专一性水解酶类，而本研究中化肥氮虽采用尿素，但化肥处理土壤中脲酶活性却显著低于有机肥处理。这是由于土壤中的脲酶多来源于动植物残体[21]，而本试验选用土壤在培养前，已将土壤中残留的动植物残体等异物去除，使得脲酶含量处于较低水平。将尿素施入土壤后，在脲酶的作用下尿素逐渐水解产生铵态氮，作为酶促反应产物的铵态氮含量快速增加，从而抑制了脲酶的酶促反应，使得脲酶活性处于较低水平[43]。本试验中，化肥对土壤脲酶、蛋白酶、天冬酰胺酶活性的影响不显著，而鸡粪、猪粪、牛粪显著提高了土壤中这3种酶的活性，这与宋震震等[10]、张影等[22]和韩阳[44]的研究结果一致，这是因为本试验选用的复垦土壤较为贫瘠，单施化肥不能为微生物生长繁殖提供充足的碳源和营养元素，而与化肥相比，有机肥施入土壤不仅带入了大量酶，提高了土壤微生物种群数量，还为产酶微生物的增殖提供了充足的有机质、磷和钾等营养物质，增加了土壤中的酶活性[45]。

本试验结果表明，有机肥对土壤谷氨酰胺酶活性影响不显著，而化肥处理土壤的谷氨酰胺酶活性在培养过程中呈降低趋势。这与杨庆[23]的研究结果相似，是因为随培养时间延长土壤中铵态氮含量下降，不足以为谷氨酰胺酶繁殖和活动提供所需的能量，导致谷氨酰胺酶活性降低。相关分析表明，本试验中土壤铵态氮含量、净氮矿化、硝化速率与天冬酰胺酶活性之间呈极显著相关，这是由于天冬酰胺酶活性能够反映土壤中含氮有机化合物的转化动态[46]。但有研究显示，施用有机肥（沼液）后，土壤铵态氮、硝态氮含量与天冬酰胺酶活性没有显著相关关系[47]。目前，关于有机肥对土壤天冬酰胺酶活性的研究较少，影响土壤酶活性的因素也较多，因此，施用有机肥对土壤中天冬酰胺酶活性的影响尚需进一步研究。

4 结论

本研究结果表明，在同一施氮水平下，单施化肥和有机肥与空白对照相比对复垦土壤氮素的矿化和硝化有促进作用，有机肥中鸡粪的促进效果优于猪粪和牛粪。有机肥处理与化肥和空白对照相比显著增加了土壤中脲酶、蛋白酶和天冬酰胺酶活性。因此，在进行矿区土壤复垦时可以选择施用有机肥进行培肥。由于本试验的施肥方式为单施有机肥或化肥，接下来可以对有机肥和化肥配施后矿区复垦土壤氮素的矿化特征进行研究。