番茄PLC基因家族鉴定及抗番茄褐色皱果病毒（ToBRFV）防御反应分析

方远鹏 韦建明 李云洲

（贵州大学农学院植物病理教研室，贵州贵阳 550025）

番茄褐色皱果病毒（Tomato brown rugose fruit virus，ToBRFV）属于帚状病毒科（Virgaviridae）烟草花叶病毒属（Tobamovirus）［1-2］。2014年首次在以色列报道，目前该病毒已逐步扩散到包括我国在内的多个国家［1-4］。2021年4月，ToBRFV被我国列为检疫性病毒，严重威胁我国乃至世界番茄的安全生产［5］。

信号转导系统在植物细胞抵御病原侵染的免疫过程中发挥重要作用，其中，质膜受体是植物响应外界病原侵染进而产生免疫过程中的重要成分，如受体类蛋白（receptor-like proteins，RLPs）、细胞内核绑定富亮氨酸重复蛋白（nucleotide-binding leucine-rich repeat proteins，NB-LRRs）［6-7］。利用细胞膜识别受体，植物可以识别细胞内外的各种病原激发子。其中识别受体与病原物激发子的相互作用在植物叶片将介导植物细胞坏死或过敏反应（hypersensitive response，HR）导致的植物免疫反应，从而促进植株对病原的抗性作用的形成［8］。

胞外信号通常可通过磷脂跨膜信号受体蛋白感知外界信号［9］，并在外界信号刺激下直接或间接激活磷脂酶，通过激活磷脂酶使第二信使分子大量横向扩散，例如促进钙离子（Ca2+）的大量增加。此外，受激活的磷酸肌醇特异性磷脂酶C（phosphati-dylinositol-specific phospholipase C，PI-PLC）可导致磷脂酰肌醇（4，5）-二磷 酸［phosphatidylinositol（4，5）-bisphosphate，PIP2］水解转化为二酰基甘油（diacyl-glycerol，DAG）和三磷酸肌醇（inositol trisphosphate，IP3）［10-12］。在动物细胞中发现，磷脂酰肌醇（4，5）-二磷酸（PIP2）是肌动蛋白（actin）组织和膜运输的关键调节剂，可与多种蛋白质相互结合。同时，PIP2浓度的降低及其反应产物DAG和IP3浓度的增加均可影响信号分子的功能。其中，DAG可从细胞质膜上对蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）进行激活，IP3则被释放到细胞质中并与细胞内膜中的配体门控Ca2+通道（IP3受体）结合，从而释放细胞储存的Ca2+。而在植物中，PIP2分子可发挥与动物细胞在细胞骨架和细胞膜中的相似功能，但是PLC的反应产物DAG和IP3的功能却有所差异［10-12］。由于植物信号中包括PKC和IP3受体的等效物的大量缺乏，现有研究认为在植物中可能转变为磷脂酸（phosphatidic acid，PA）和二酰基甘油焦磷酸、肌醇六磷酸（IP6）作为该信号系统的主要第二信使分子［13-17］。多种植物基因组可以编码PI-PLC，并由PI-PLC的激活响应外界多种信号（如高温、低温、盐和渗透胁迫）或内源信号物质（如脱落酸）［13-20］。因此，探明植物磷脂酶C以及其信号功能存在重要的意义。

信号转导在植物响应外界生物胁迫（如真菌、细菌、病毒）或非生物胁迫（如低温、高温、干旱以及盐胁迫）过程中发挥着重要的作用［21-24］。而Ca2+、DAG、IP3是植物细胞中重要的信号分子，可被磷脂酶C进行直接或间接的调控。其中，植物磷脂酶C包括磷脂酰肌醇特异性结合的PI-PLC蛋白，其核心结构为PLCXc域、PLCYc域和C2结构域，可介导IP3/Ga2+及DAG/PA信号传导；磷脂酰肌醇非特异性结合的NPC蛋白，其核心结构为Phosphoesterase结构域，可介导DAG/DGK（DAG kinase）信号传导［25-27］。近期研究表明，植物磷脂酶C可直接介导植物-病原的抗性反应，例如拟南芥（Arabidopsis thaliana）PLC基因可受丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的两种效应因子AvrRpm1和AvrRpt2诱导表达，其NPC基因也受丁香假单胞菌（P.syringae）所诱导［28］；番茄PI-PLC基因可以被叶霉病菌（Cladosporium fulvum）诱导表达［29］；水稻（Oryza sativa）PI-PLC1参 与 水 稻 黄 单 胞 菌（Xanthomonas oryzae）诱 导的防御反应［30］。另外，DGK或IP3信号物质可以间接介导植物天然免疫系统，例如水稻DGK下游基因-甘油二酯激酶基因1OsBIDK1的转基因烟草（Nicotiana benthamiana）可提高对烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）的 抗 性［31］；拟南芥AtIPS2（myo-inositol 3-phosphate synthase）下调导致植株对TMV的抗性下降［32］。

目前两种类型磷脂酶C基因家族已经在拟南芥（Arabidopsis thaliana）［32］、水稻［33］、玉米（Zea mays）［34］、陆 地 棉（Gossypium hirsutum）、木 本 棉（Gossypium arboreum）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）［35］中分别鉴定，其中PI-PLC分别有9、4、5、12、9、9个，而NPC基因分别有6、5、4、9、6、6个。然而，关于番茄（Solanumlycopersicum）磷脂酶C基因的系统鉴定尚不完整［25］，并且其参与植株抗病毒防御反应中的作用仍不明确。鉴于此，本研究鉴定番茄基因组中磷脂酶C基因，并分析不同类型磷脂酶C基因的理化性质、进化特征以及表达特征。然后基于转录组进一步筛选鉴定PLC基因是否参与番茄植株抗ToBRFV防御反应，以期为开展番茄磷脂酶C（PLC）抗病毒、育种研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 番茄PLC基因家族的鉴定

基于拟南芥磷脂酶C蛋白序列及隐马科夫模型（C2结构域PF00168或Phosphoesterase结构域PF04185）采用EnsemblPlant（http：//plants.ensembl.org/index.html）和Sol Genomics Network（https：//solgenomics.net/）数据库对番茄基因组进行Blast和Hmmer搜索［36］，所获结果置于SMART和PFAM数据库进行结构域的确认，保留所有编码蛋白具备典型结构域的基因［37］。基于番茄基因组注释文件获得PLC基因的基本信息后利用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）和PSORT（http：//psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html）进行基础理化性质和亚细胞定位分析［38］。

1.2 番茄PLC蛋白的系统发育分析

拟南芥、水稻、玉米、大豆（Glycine max）和棉花序列分别来自TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）、水稻基因组数据库（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）、EnsemblPlant、Phytozome基 因 组 数 据 库（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）及Cottongen（https：//www.cottongen.org/）［32，34-35，39-40］。

根据各物种PLC基因家族蛋白序列通过Clustal W方法对齐，并利用MEGA 7.0构建进化树，建树方法为相邻连接法（Neighbor-Joining，NJ），bootstrap=1 000［41］，参照其与拟南芥PLC蛋白的同源性进行命名。多序列比对分析由DNAMAN5.0软件完成。

1.3 保守基序的鉴定及蛋白结构分析

利用MEME（http：//meme.Nbcr.net/meme/intro.html）［42］、SOPMA 2.0（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.plpage=npsa-sopma.html）［43］对番茄PLC蛋白最保守的10个保守基序以及二级结构进行分析。Swiss Model（https：//swissmodel.expasy.org/）及PyMOL软件完成蛋白质三级结构的预测与绘图。

1.4 基因结构和进化特征分析

基于MC sanX软件对番茄及其他植物PLC家族基因的种间共线性情况进行分析，并利用TBtools v1.064对其基因结构和共线性关系进行绘制［44-45］。拟南芥、水稻、雷蒙德式棉花的基因组序列来自TAIR、EnsemblPlant、Cottongen网站。

1.5 PLC基因的组织表达与病毒侵染表达分析

基于TomExpress（http：//tomexpress.toulouse.inra.fr/）检查番茄PLC基因在不同组织的表达特征［46］。ToBRFV来自贵州大学农学院植物病理教研室番茄抗病抗逆研究课题组，ToBRFV接种试验在封闭的植物培养间进行，严格执行检疫标准。处理组和对照组均进行3次重复，记为R1～R3，其中处理组和对照组分别摩擦接种ToBRFV、水后14 d待植株生长点显现病症，采集生长点病样0.5 g送往上海美吉生物公司测序。PLC基因表达数据是来自本课题组所测转录组数据，最终将数据在TBtools v1.064中绘制热图（采用log2与row scale标准化）。

2 结果与分析

2.1 番茄PLC基因家族鉴定及基本理化性质分析

基于磷脂酶C的核心结构域进行鉴定，共获得7个PI-PLC和3个NPC。采用系统发育树进行分类，结果显示，番茄的3个NPC基因分别为拟南芥NPC1、NPC2、NPC6的直系同源基因。而PI-PLC基因可大致划分为五大类，即PI-PLC1/3/8/9、PI-PLC2/7、PI-PLC6、PI-PLC4/5及单子叶PI-PLC分支，番茄的7个PI-PLC基因分别具备1、3、1、2、0个不同类别的PI-PLC基因（图1）。同时，这些番茄PLC蛋白大多处于500 aa附近，部分PI-PLC蛋白达605 aa（SlPLC2a）和884 aa（SlPLC6 a）。分子量多在50～70 kDa之间，仅SlPLC6a超过100 kDa。在等电点方面，3个NPC蛋白分别为8.53、6.97、7.33，7个PI-PLC蛋白均处于5～8之间。

图1 番茄、拟南芥、水稻、玉米、棉花、大豆PLC蛋白的系统发育树分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of PLC proteins in tomato，Arabidopsis，rice，maize，cotton and soybean

表1 番茄PLC基因家族基本理化性质Table 1 The Basic physical and chemical properties of PLC gene family in tomato

2.2 番茄PLC基因的基因结构、保守基序分析

基于MEME网站预测PLC蛋白的保守基序显示，PI-PLC和NPC蛋白均具备丰富的保守区域，其中NPC蛋白预测出3个motif，即motif 3、motif 7、motif 8，且均在各NPC蛋白中保守存在；另外，PI-PLC蛋白预测获得7个motif，即moif 1/2/4/5/6/9/10。其中，番茄PLC6类蛋白具备更多的motif 10片段，SlPLC6a、SlPLC6b分别具备4、2个motif 10区域（图2-A、B）。如图3所示，motif 10处于PLC_Yc区域前端，具备两个核心保守区域：YxxLI、RxSxxE。

基于注释信息进行基因结构分析，结果显示NPC类基因与PI-PLC类基因结构复杂度差异较大，但其内部的不同亚类差异较小。NPC基因内含子多为0～4个，而PI-PLC基因内含子数多超过7个。值得注意的是，番茄PLC基因内含子数与水稻、拟南芥相似，但其内含子区域相对更长（图2-A、C）。

图2 番茄、拟南芥、水稻PLC基因结构与保守基序分析Fig.2 Structure and motif analysis of PLC gene in tomato，Arabidopsis and rice

2.3 番茄PLC高级结构分析

对其氨基酸序列进行分析结果显示，番茄PLC蛋白的亚细胞定位中，不同类的NPC和PI-PLC间存在差异，其中NPC1蛋白和PI-PLC2主要位于线粒体，而NPC2位于高尔基体，NPC6定位于胞外，PI-PLC3、PIPLC4类蛋白主要位于细胞质中。另外，不同蛋白间可能存在更多样的潜在定位，例如SlPLC6a较SlPLC6b具备多线粒体的潜在定位（表2）。

基于SOPMA 2.0算法对番茄磷脂酶C的二级结构进行预测，结果显示番茄PLC以无规则卷曲为主，其次是α-螺旋，再次是延伸链。同时，在不同亚类和不同磷脂依赖性的PLC中，三种二级元件的占比相对类似（表2）。进一步采用同源建模法对10个PLC蛋白进行建模，结果显示，三级结构的结果与二级结构基本一致，但不同PI-PLC蛋白亚类间的空间结构差异较大，且在同类PI-PLC蛋白间也存在一定差异（图3、4）。

表2 PLC家族蛋白二级结构及亚细胞定位分析Table 2 Analysis of the secondary structure and subcellular localization of PLC family proteins

图3 基序10的标志Fig.3 Logo of motif 10

2.4 番茄PLC基因的复制模式分析

基于番茄PLC基因在水稻、拟南芥、棉花基因组中尚存的共线性关系进行分析，以揭示其功能相似性和进化历程。结果显示，3个番茄PI-PLC基因（SlPLC2a、SlPLC3、SlPLC4）同水稻OsPLC4存在共线性。而在番茄和拟南芥、番茄与雷蒙德式棉PLC基因间分别存在12、16对共线性关系，包括2对（AtNPC2-SlNPC2、AtNPC6-SlNPC6）、1对（GrNPC1-SlNPC6）NPC基因的共线性关系和10对（SlPLC2a-AtPLC6、SlPLC2b-AtPLC6、SlPLC3-AtPLC1、SlPLC3-AtPLC6、SlPLC4-AtPLC1、SlPLC4-AtPLC9、SlPLC6a-AtPLC6、SlPLC6b-AtPLC6、SlPLC6a-AtPLC7、SlPLC6b-AtPLC7）、15对（SlPLC2a-GrPIPLC9、SlPLC2b-GrPIPLC8、SlPLC2b-GrPIPLC9、SlPLC3-GrPIPLC1、SlPLC3-GrPIPLC2、SlPLC3-GrPIPLC6、SlPLC3-GrPIPLC8、SlPLC3-GrPIPLC9、SlPLC4-GrPIPLC2、SlPLC6a-GrPIPLC6、SlPLC6a-GrPIPLC8、SlPLC6a-GrPIPLC9、SlPLC6b-GrPIPLC6、SlPLC6b-GrPIPLC8、SlPLC6b-GrPIPLC9）PI-PLC基因的共线性关系（图5）。

图5 番茄PLC基因在水稻（A）、拟南芥（B）、雷蒙德式棉（C）基因组中的共线性关系Fig.5 Collinearity of tomato PLC genes in rice（a），Arabidopsis（b）and Raymond cotton（c）genomes

由于PI-PLC基因在番茄和水稻间的共线性信息相互支撑，表明PI-PLC基因的潜在演化路径为单子叶，PI-PLC4基因演化为双子叶PI-PLC6基因的PIPLC分支基因。另外，番茄NPC基因可能来源于NPC亚类基因，而PI-PLC基因的丰富与不同亚类基因的扩展有关。

2.5 番茄PLC基因组织表达分析

基于番茄PLC基因的组织表达数据，对单一基因及PLC整体的表达情况进行分析。结果显示，各PLC基因在各组织的表达上存在明显的组织表达特异性；NPC基因在果中表达水平最高，其次是叶、根，PI-PLC基因则在叶（SlPLC2a、SlPLC2b、SlPLC3）、根（SlPLC6a、SlPLC6b）、果（SlPLC2s、SlPLC4）、花（SlPLC2a、SlPLC2c、SlPLC6b）中表达水平较高。同亚类番茄PLC基因也存在明显表达差异，例如SlNPC1和SlNPC2/6表达存在差异，前者以成熟果中表达水平最高，而后者以幼果表达最高（图6-A～J）。另外，基于其整体的表达水平，发现SlPLC3、SlPLC6a基因表达水平最低，而SlNPC1、SlPLC2b、SlPLC4表达水平最高，其余基因表达水平居中。SlPLC2a在根、组织、种子、幼苗、花中表达水平达极高水平（图6-K）。

图6 番茄各PLC基因的组织表达（A-J）及整体的组织表达水平（K）分析Fig.6 Expression analysis of the PLC genes in different tissues for single（A-J）and all（K）genes

2.6 番茄PLC基因抗ToBRFV侵染响应分析

基于接种ToBRFV的转录组测序数据提取PLC基因的侵染响应表达数据，对各PLC基因在病毒侵染中的作用进行分析。结果显示，除SlPLC6b未获得相关测序结果外，各PLC基因在ToBRFV侵染过程均存在一 定 的 响 应。其 中，SlNPC1、SlNPC6、SlPLC4在ToBRFV接种的样本中表达水平升高，而其他PLC基因则在ToBRFV接种后表达水平降低（图7）。

图7 番茄PLC基因家族接种ToBRFV的叶片表达分析Fig.7 Leaf expression analysis after the tomato PLC gene family was vaccinated against ToBRFV

图4 番茄PLC蛋白三级结构分析Fig.4 Tertiary structure analysis of tomato PLC protein

3 讨论

发掘新的植物抗病毒基因是植物抗病毒研究和抗病毒育种的前提，也是病毒病防治最有效的方式［47］。早期研究认为，植物的天然抗病毒机制主要是R基因介导的抗病毒机制和RNA沉默机制［48-49］；近年来，病毒抗性与钙依赖的Ca2+信号介导途经的关系被大量报道［50］。然而，同样作为重要信号通路的膜脂信号相关蛋白与抗病毒的研究甚少。本研究鉴定的番茄PCL家族属于磷脂信号转导的核心组件，可介导DAG、PIP、Ga2+等多种第二信使分子［25-27］。但是，目前对于番茄磷脂酶C（PLC）的分布、结构、抗病毒潜力等均不明确。为此，本研究对番茄中两类PLC（NPC、PI-PLC）基因进行识别，共获得10个PLC分子（7个PI-PLC和3个NPC），这一特征与其他双子叶的PLC基因的分布基本相似，即PI-PLC分支基因多于NPC分支基因［32-35］。构建系统发育树发现，番茄具备拟南芥NPC1、NPC2、NPC6、PLC2、PLC3、PLC4、PLC6的同源蛋白，且番茄PLC2和PLC6分别具备3、2个拷贝。综上，PCL在番茄中起重要作用，且该基因家族在进化过程中一直维持其同源性。

由于植物基因组丰富的演化，导致大部分基因家族成员之间的功能多样性，包括组织特异性表达不同和逆境响应的差异［32-35］。在先前的大豆PCL研究中发现达到磷脂酶C（GmPLC）基因同样存在明显的组织特异性表达；例如，大豆磷脂酶C7（GmPLC7）在根中表达最高，而大豆磷脂酶C5（GmPLC5）在根中表达最低，大豆磷脂酶C2/4/8（GmPLC2/4/8）在根中均不表达［40］。为此，本研究基于已经公布的番茄基因表达谱，分析番茄PLC基因的组织特异性，结果显示，NPC基因在番茄果实中的表达水平最高，其次是叶、根；而PI-PLC基因则 在 叶（SlPLC2a、SlPLC2b、SlPLC3）、根（SlPLC6a、SlPLC6b）、果（SlPLC2s、SlPLC4）、花（SlPLC2a、SlPLC2c、SlPLC6b）中的表达水平较高。由此推测NPC在番茄果实发育中发挥作用，而PI-PLC在叶片中发挥作用。

另外，有报道证明多种病原菌侵染可以诱导磷脂酶C的抗病防御反应，如丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）、水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）、叶霉病菌（Cladosporium fulvum）等多种病菌均可诱导寄主植物的PLC基因的表达或酶活性发生改变［28-29］。同时，一些磷脂酶C的下游信号分子与病毒侵染过程有着重要的作用，例如水稻BIDK1（OsBIDK1）的转基因烟草具备更强的TMV抗性［31］，暗示过表达磷脂酶C下游信号分子相关基因可以提供植株对病毒的抗性；而下调拟南芥IPS2基因（AtIPS2）的拟南芥植株对TMV的抗性会下降［32］。这些结果表明磷脂酶C可能在植株抗病毒过程中发挥重要的调控作用。为此，本研究基于转录组测序分析番茄PLC基因受ToBRFV侵染的响应表达情况，结果显示SlNPC1、SlNPC6、SlPLC4可受ToBRFV接种诱导表达水平升高，其他PLC基因因ToBRFV侵染导致其表达受抑制，表明番茄部分PLC（SlNPC1、SlNPC6、SlPLC4）可能参与调控番茄对ToBRFV病毒的抗性，但番茄PCL的具体功能及抗病毒机制仍需进一步研究。

4 结论

本研究鉴定出10个番茄PLC基因，可分为2个亚家族：PI-PLC和NPC。根据结构相似度划分为7个分支，分别为NPC1、NPC2、NPC6、PI-PLC2、PI-PLC3、PIPLC4、PI-PLC6。共线性分析显示，番茄PLC基因与水稻、拟南芥、棉花PLC基因间分别存在3、12、16对共线性关系。番茄PLC基因中SlNPC1、SlNPC6、SlPLC4参与ToBRFV诱导防御反应。