氧化三甲胺测定方法的研究进展*

张 野，时 景，张 明

(1 九州职业技术学院，江苏 徐州 221000；2 徐州市康复医院，江苏 徐州 221000)

氧化三甲胺(trimetlylamine oxide, TMAO)是一种稳定性较好、易溶于水的小分子胺。不仅存在于海洋生物中，在人体内也可经肠道菌群代谢卵磷脂、胆碱、肉碱等原料生成[1]。人体内TMAO的含量相对较少，但其血浆浓度与人们的饮食习惯、肠道菌群关键酶的活性密切相关。近年来，不少研究发现，TMAO在血浆中的高浓度与动脉粥样硬化面积的大小、脑卒中和心肌梗死的风险增加有关[2-3]；在糖尿病人血浆的检测中也发现，T2MD患者血浆TMAO浓度及胆碱等前体物质浓度比健康人群水平高要高[4]；在肾损伤动物体内，肾损伤分子-1水平与血液中TMAO含量成正比，提示高水平TMAO可能是促进肾脏纤维化的重要危险因素[5]，因此，TMAO在人体血浆或尿液中水平的升高可能在心血管疾病、糖尿病、肾病等慢性疾病中发挥重要作用，找到快速、精准检测TMAO的方法尤对于慢性疾病的临床筛查和诊断显得尤为必要。TMAO作为慢性疾病标志物的新希望，其研究方法的推进也会为临床提供更科学的预防手段和治疗方法[6]。

1 TMAO的来源与代谢

TMAO是式为 (CH3)3NO 的天然化合物，大量存在于海洋生物中[7]。作为一种有效的蛋白质稳定剂，TMAO可保护海洋动物免受温度、盐度、高尿素和静水压力的不利影响[8]。TMAO可被海洋动物的内源酶或细菌酶降解为二甲胺(DMA) 或三甲胺 (TMA)，也可将其还原用于评估海产品的质量。在人类中，TMAO主要来源于肠道，肠道微生物群可将饮食中的肉碱、胆碱等含胆碱化合物转化为TMA，TMA通过被动扩散迅速吸收到门静脉循环中，然后再通过肝脏中的肝黄素单加氧酶(FMOs)转化为TMAO[9]。值得注意的是，肝脏FMOs中FMO1的活性比FMO3低10倍，因此，FMO3是负责将 TMA 转化为 TMAO的主要酶。

TMAO在体内的代谢研究相对较少。有研究发现，40名健康男性在口服TMAO后，血浆中氘标记的d9-TMAO最早可在15 min内被检测到，1 h后水平升高，给药后6 h内仍保持较高水平，最终被完全吸收[10]。TMAO被吸收后一般可在24 h内以95%的比例经肾脏从尿液中排出，4%从粪便途径排出，近1%从呼吸道排出。此外，TMAO也可以被一些含有TMAO去甲基化酶的产甲烷的菌群代谢为二甲胺(DMA)、甲醛、氨和甲烷[11]。

2 TMAO的测定方法

近年来，TMAO在血浆、脑脊液、尿液中水平的升高已经成为独立预测动脉粥样硬化、酒精性脂肪肝、阿尔兹海默等疾病等疾病的风险因素。为了尽可能减少TMAO对人类健康的影响，如何精准检测TMAO的含量尤为关键。目前TMAO的测定方法主要有比色法、离子色谱法、液相色谱-质谱联用法、酶联免疫吸附法、核磁共振法等，本文将根据相关的研究结果，总结各方法的研究进展。

2.1 比色法

比色法的检测方式主要包括直接检测法和间接检测法[12]。直接检测法主要是指雷氏盐比色法，TMAO与雷氏盐在酸性条件下相互作用生成红色沉淀，经含水乙醚和丙酮溶解后清洗、分离，再通过分光光度计测量吸光度值绘制TMAO的标准曲线进行定量[13]。间接检测法主要是指苦味酸检测法，通过三氯化钛(TiCl3)可将TMAO还原成TMA，再将TMA与苦味酸相互反应生成黄色沉淀，比对标准色卡确定TMA的含量，进而换算得到TMAO的含量[14]。

2.2 离子色谱法

离子色谱法是基于离子交换的原理，对色谱固定相上的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间进行的可逆交换，用以定性和定量的方法。孙永等[15]使用4 mmol/L硝酸+3%乙腈淋洗，0.9 mL/min的流速进行样品分离，建立了一种非抑制性离子色谱法，这种方法可同时测定水产品中TMAO及其分解产物，不仅样品的预处理过程简单，且加标回收率和精密度也较好，具有较高的实际应用价值。需要注意的是，如果生物样品中存在Na+、K+、Mg2+等阳性离子，可能会对胺类物质的检测造成干扰和影响，因此，采用离子色谱法对TMAO进行检测可能不是最优方法，需要对样品进行预处理。

2.3 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法是一种利用特定抗体与抗原或半抗原发生的高选择性、高特异性识别和结合原理，对待测抗体或者抗原进行分析测定的方法，具有灵敏度高、检测迅速稳定、重复性好、成本较低的优点。目前，市面上以医院为研究单位开发的有关TMAO的ELISA方法检测方法较多，以山东大学为例，2018年山东大学第二医院发明构建了基于TMAO的多酶组合体系，荧光测定TMAO的检测方法，该方法克服了TMAO代谢途径中没有NAD依赖脱氢酶参与，无法直接耦合的缺点，对于医院系统的大数据调研和多因子分析具有重要意义。

2.4 液相色谱-质谱联用法

液相色谱-质谱联用是利用液相色谱作为质谱的进样系统，使复杂的化学组分先得到分离，再利用质谱作为检测器进行定量和定性化学分析方法，是目前被广泛认可的检测TMAO的方法，具有灵敏度高、特异性好、可同时分析多个成分及定量准确度高等特点。Wang等[16]采用液质联用的方法，通过标记TMAO的含量，确定了血液TMAO浓度与心血管疾病之间的关系。Zhao等[17]基于液质联用并结合稳定的同位素稀释法，同时测定了人血浆和尿液中胆碱、甜菜碱、TMA、TMAO含量，并通过使用低、中、高水平加标的质量控制，验证了该测定方法的准确性。Katharina等[18]基于 LC-MS/MS 开发了一种不需要同位素标记就能检测 TMAO 及其前体胆碱、肉碱和甜菜碱的含量的方法，这种方法速度快、处理量高、消耗的样品量低，是具有成本效益的方法，有助于在临床实践中测量生物标志物，以评估 CVD 发展的风险，或监测疾病进展和干预效果。但也有研究表明，二者联用的技术虽灵敏度高，但步骤繁琐，成本也相对昂贵，在衍生环节可能使TMAO发生降解，在一定程度上影响临床的大规模筛查。

2.5 核磁共振法

核磁共振法主要是利用核磁共振光谱对物质结构进行研究的一种定性和定量的方法[19]。该方法不需要对样品进行预处理，也不需要购买同位素标记的内标物质，只需要加入缓冲液即可进行检测分析，在代谢组学的应用中较为广泛。Wang等[20]基于核磁共振的分析方法，深入研究了临床血清或血浆样本中TMAO的水平，以评估心血管疾病风险和个体化饮食监测。Helena等[21]也通过核磁共振法探索研究了鱼类的摄入量与人类尿液中TMAO含量的相关性。尽管与质谱法相比，核磁共振分析法可能具有灵敏度不够等缺点，但该技术具有简单、快速、准确的特点，因此在血液中含量并不算太低的氧化三甲胺物质的定量分析方面依然可以较方便地使用。

3 结 语

近年来，随着人们对TMAO的深入研究，越来越发现其在人类健康疾病中的重要作用，对TMAO的预防和监测在临床中显得尤为重要。目前，胺类化合物特别是TMAO的含量测定已然成为研究热点。现有的文献表明，虽然TMAO的检测方法仍存在有误差、步骤繁琐、成本高等局限性，但比以往研究已取得长足进展。研究显示，比色法经典，但其灵敏度、重复性较差，易与其他的胺类物质发生反应，导致测量结果不准确，更适合水产生物的检测；离子色谱法在离子交换过程中容易受液质联用技术在检测TMAO上比酶联免疫法、核磁共振法更有优势。因为液质联用对TMAO这种极性大、不具挥发性的胺类物质分离情况更好，也可以实现简单上机分析、无需沉淀的过程，大大提高了通量，缩短了分析时间；尽管酶联免疫吸附法看似简易操作，但不同医院研发和采用的试剂盒的基线标准并不一致，成本也相对较高；核磁共振分析法作为代谢组学研究的新兴技术，虽然省去了很多样品的前处理过程，但其价格昂贵，操作复杂，需要专业人员对数据进行解读。总之，我们可能迫切需要研发一种快速、准确、成本低并适合临床实验室大规模筛查TMAO的方法，为提前预防TMAO诱发的疾病提供便捷途径。