口虾蛄总生物碱对人鼻咽癌CNE-2Z细胞周期与凋亡的影响*

齐相薇 林荣文 蔡康荣 王槐高

(广东医科大学 1.临床技能培训中心；2.科研中心；3.病理生理学教研室,广东 东莞 523808)

目前我国鼻咽癌在中南部两广地区(广东、广西、湖南等)高发，随着经济发展及人口老龄化的出现，发病率可能还会上升；同时鼻咽癌的预后较差，死亡率也相对较高[1]。放射治疗是目前鼻咽癌首选的治疗手段, 调强放疗技术可提高肿瘤靶区剂量,同时减少周围正常组织照射剂量[2]，但是电离辐射杀灭肿瘤的同时，也可以诱导许多基因和蛋白质表达水平的变化，导致肿瘤对电离辐射的敏感性降低，并出现辐射抗性的发展[3]。鼻咽癌对放射治疗比较敏感，患者的五年生存率可明显提高，但放射治疗同时会损伤患者头颈部的其他组织，引起如头晕头痛、口干、听力下降、颈部纤维化及放射性龋齿等多种毒副作用[4]，放射治疗后复发率不低。临床研究证明辅助化疗联合放疗或联合化疗可改善鼻咽癌晚期患者的预后[5-6]。前期研究结果表明[7]，口虾蛄乙酸乙酯提取物可能通过影响P53蛋白的表达,干扰COX-2和VEGF的表达而发挥抑制CNE-2Z细胞增殖。本研究根据新的提取方法获得口虾蛄总生物碱，观察其对鼻咽癌细胞株CNE-2Z增殖、细胞周期及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株和原料 人鼻咽癌CNE-2Z细胞由广东医科大学分子诊断重点实验室提供。于海鲜市场购买新鲜口虾蛄，经鉴定属节肢动物门，甲壳纲，口足目，虾蛄科品种。

1.1.2 试剂 RPMI 1640培养基购自GIBCO公司， Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自日本同仁株式会社化学研究所，细胞周期检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，兔抗人Caspase8多抗购自Cell Signaling公司，鼠抗人β-actin单抗、羊抗兔、羊抗鼠 II 抗购自SIGMA公司，其余均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 口虾蛄总生物碱提取及初步鉴定 以每公斤口虾蛄加水3 L绞碎，酸化后，恒温60℃浸泡过夜，离心后取上清液，调至pH>10。次日离心后取沉淀以乙酸乙酯分3次萃取，减压浓缩得到总生物碱，具体操作方法参考前期研究结果[8-9]。总生物碱以氯仿-环乙烷(10∶1)溶剂薄层层析展开，采用改良碘化铋钾显色初步定性分析。总生物碱以DMSO溶解分装，临用以培养液稀释成所需浓度(DMSO的终浓度≤0.1%)。

1.2.2 分组 采用不同浓度(0、50、100 mg/L)的口虾蛄总生物碱处理人鼻咽癌CNE-2Z细胞，分别记为对照组、50 mg/L组、100 mg/L组。

1.2.3 CCK-8检测总生物碱细胞体外抗肿瘤作用 人鼻咽癌CNE-2Z细胞培养24 h后,制成单细胞悬液后调整细胞密度，滴入总生物碱溶液，使质量终浓度分别为5、25、125、625 mg/L，培养48 h并于终止培养前1 h，加CCK-8溶液混匀，孵育2 h后，进行CCK-8检测，以试剂盒流程操作，取得细胞增殖抑制率。计算公式：抑制率%=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.4 平板克隆实验法检测总生物碱抑制细胞克隆形成能力 胰蛋白酶消化对数生长期CNE-2Z细胞制成细胞悬液，以每孔400个细胞接种于6孔细胞培养板，待细胞贴壁后，每孔换以0.1%胎牛血清的1640培养24 h，加入总生物碱调整终质量浓度(0、50、100 mg/L)，培养2周；PBS清洗细胞后甲醇固定0.5 h，结晶紫染色0.5 h，缓流清水冲洗后空置干燥；以网格透明胶片置培于培养板底部，低倍镜计数大于10个细胞的克隆数，计算克隆形成率。计算公式：克隆形成率=(克隆形成数/接种总细胞数)×100%。

1.2.5 流式细胞仪检测总生物碱对细胞周期分布的影响 胰蛋白酶消化对数生长期CNE-2Z细胞并制成细胞悬液，接种于6孔细胞培养板，待细胞贴壁后换培养基继续培养24 h，加入总生物碱调整终质量浓度(0、50、100 mg/L)继续培养24 h，每组重复3个培养孔；预冷的70%乙醇固定胰蛋白酶消化后收集细胞，保存于 4℃；次日离心，PBS洗涤后，以含质量终浓度碘化丙啶(PI)100 mg/L和RNase100 mg/L的染色液0.5 mL染色，在常温下避光染色0.5 h，于流式细胞仪检测细胞周期变化。

1.2.6 蛋白免疫印迹实验检测Caspase8蛋白表达 人鼻咽癌CNE-2Z细胞培养24 h后,制成单细胞悬液后调整细胞密度，滴入总生物碱溶液，使质量终浓度分别为0、50、100 mg/L，培养24 h，加入裂解液，提取细胞总蛋白；选用BCA法测定蛋白浓度，调整蛋白样品浓度均一后以SDS-PAGE凝胶电泳将蛋白转移到 PVDF 膜上，封闭2 h，加入 I 抗 [Caspase8(1∶500)]，保存于4℃封闭过夜；加入Ⅱ抗(1∶10 000)，室温下摇动孵育2 h。以β-actin为内参照。Odyssey扫描成像后继用Quantity one 软件分析。

2 结果

2.1 口虾蛄总生物碱薄层层析显色结果 口虾蛄总生物经薄层层析显色，有4个颜色相同的色斑,为复合化合物，见图1。显色反应表明其化学性质为生物碱类物质。

图1 薄层色谱法测定总生物碱结果Figure 1 Results of total alkaloid detected by TLC

2.2 口虾蛄总生物碱抑制CNE-2Z细胞的增殖 不同质量浓度的总生物碱(5、25、125、625 mg/L)作用CNE-2Z细胞24、48、72 h后，与对照组相比，细胞的增殖受到明显抑制。随药物浓度增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制率逐步增加，具有明显的剂量-时间-效应关系。采用Bliss算法软件统计得到， 其作用于CNE-2Z细胞24、48和72 h的IC50分别为(578.17±0.65)mg/L、(86.27±0.73)mg/L和(63.31±0.35)mg/L，见图2。

图2 总生物碱对CNE-2Z细胞增殖的抑制作用Figure 2 Total alkaloid inhibited the proliferation of CNE-2Z cells

2.3 口虾蛄总生物碱抑制CNE-2Z细胞的克隆形成能力 不同质量浓度的总生物碱(0、50、100 mg/L)作用CNE-2Z细胞，观察细胞克隆形成能力的改变。与对照组相比，CNE-2Z细胞的克隆形成能力明显降低；随着总生物碱浓度的增加，其克隆形成数目和克隆形成大小均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图3 总生物碱抑制CNE-2Z细胞的克隆形成Figure 3 Total alkaloid suppressed colony formation of CNE-2Z cells注：与对照组相比，① P<0.05

2.4 口虾蛄总生物碱对CNE-2Z细胞周期的影响 不同质量浓度的口虾蛄总生物碱(0、50、100 mg/L)作用CNE-2Z细胞24 h后，流式细胞术检测细胞周期分布的改变。与对照组相比，口虾蛄总生物碱能诱导CNE-2Z细胞周期S期比例由11.7%上升为31.5%，而G0/G1期比例由85.5%下降为56%，呈一定的剂量依赖性，见图4。提示口虾蛄总生物碱能将CNE-2Z细胞周期阻滞于S期。

图4 总生物碱作用后CNE-2Z细胞周期分布Figure 4 The effect of total alkaloid on the cell cycle distributions in CNE-2Z cells注：与对照组相比，①P<0.05

2.5 口虾蛄总生物碱对CNE-2Z细胞Caspase-8蛋白表达的影响 以总生物碱0、50、100 mg/L处理CNE-2Z细胞24 h后，与对照组比较，蛋白免疫印迹实验检测结果表明caspase-8酶原的蛋白表达随浓度增加而减少，有一定的剂量依赖关系，见图5。

图5 总生物碱对CNE-2Z细胞Caspase8蛋白表达的影响Figure 5 The effect of total alkaloid on the expression of Caspase8 protein levels in the CNE-2Z cells

3 讨论

海洋生态系统的高压、高盐、缺氧、低温和低光照等独特性赋予了海洋生物多样、独特和新颖的结构，是新药研制开发药物先导化合物的重要来源。海洋生物来源的具有抗肿瘤作用的多种化合物, 包括生物碱类、萜烯类、甾体类化合物、大环内酯类和多肽等，已经进入临床不同的试验阶段或有相应产品上市[10-11]。

近年来从海洋微生物代谢产物中获得众多新的生物碱，其中部分生物碱具有高选择性和高活性而备受关注[12-13]。有研究发现从高领类尖柳珊瑚Muriceides collaris中分离得到的一种愈创木薁倍半萜生物碱Muriceidine A体外对人宫颈腺癌细胞HeLa具有较强的细胞毒作用[14]。王亚楠等[15]从泰国红树林底泥中的耐酸真菌Aspergillus fumigatus OUCMDZ-5210的次生代谢产物中分离得到6个吲哚二酮哌嗪类生物碱，其中化合物3和6对人结肠癌细胞HCT116以及人慢性髓性白血病细胞K562具有不同程度的抑制活性。本研究所前期研究发现[16]，口虾蛄乙酸乙酯提取物能抑制CNE-2Z细胞的增殖；进一步研究发现口虾蛄乙酸乙酯提取物能够抑制CNE-2Z细胞的迁移和体外血管生成拟态的能力，其机制可能与下调fascin1和VEGF蛋白的表达有关[17]。口虾蛄乙酸乙酯提取物也可抑制HepG2细胞增殖并与顺铂联合用药可产生协同抑制效应[18]。早期研究通过系统溶剂法相继得到口虾蛄乙醇粗提物、正丁醇提取物，继用乙酸乙酯萃取得到正丁醇提取物的总生物碱并进一步纯化，其生物碱类化合物对鼻咽癌细胞增殖具有明显的抑制作用[19]。综合近年的研究结果，系统溶剂法有提取工艺繁琐、溶剂及人力成本高及提取效率低下等缺点，有待改进。同时，口虾蛄抗肿瘤物质活性虽强，但是体内肿瘤抑制实验效果不佳，可能是由于系统溶法提取物，其成分、种类过于较复杂且含有抗肿瘤活性物质的量不高等原因引起的。尹田鹏等[20]采用酸提碱沉法，从贵州地区产乌头中提取总生物碱浸膏并分离纯化,获得15个二萜类生物碱类成分。沙棘叶黄酮也可以先通过酸提碱沉法进一步纯化得到[21]。故本研究采用酸提碱沉法结合乙酸乙酯萃取法，以探索提取更简单、成份抗肿瘤活性更高的方法。本方法避免了乙醇提取法、系统溶剂提取法的繁琐操作、溶剂、人力成本高等缺点，提取效率明显提高，而且还可以直接纯化总生物碱，提取物经薄层板色谱法初步鉴定为生物碱类物质。

口虾蛄总生物碱处理后，CNE-2Z细胞的增殖受到明显抑制，48 h的IC50较旧方法的乙酸乙酯提取物更低[22]。较以往研究，用更低质量终浓度50及100 mg/L的总生物碱就能明显抑制CNE-2Z细胞克隆形成能力，使细胞周期阻滞于S期。Caspase-8是控制细胞凋亡、坏死性凋亡和细胞焦亡的分子开关[23]，是细胞死亡途径的主要因子，活化的Caspase-8可以驱动经典的caspase依赖性凋亡[24]。唐旭东[25]发现用高三尖杉酯碱0、0.125、0.25、0.5和1 mg/L作用CNE-2Z细胞8 h后，Caspase-8酶原的蛋白表达随浓度增加而减少，当浓度为1 mg/L时出现活性裂解片段,Caspase-8激活而诱导CNE-2Z细胞凋亡。本研究中总生物碱作用后CNE-2Z细胞后，Caspase-8蛋白的表达水平明显下降，可能与Caspase-8激活有关，并可能继而诱导凋亡，关于凋亡的全面观察及具体机制有待进一步研究。

4 结论

口虾蛄总生物碱抗CNE-2Z细胞的作用可能通过抑制细胞增殖、诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡等发生。