一种冻干型人凝血因子Ⅷ制备方法的研究

刘环，陈红霞，李勇，邹越，孙振宇*

（1.国药集团上海血液制品有限公司，上海 200051；2.国药集团上海血液制品有限公司云南分公司，云南昆明 650000）

人凝血因子Ⅷ（Human Coagulation Factor Ⅷ，FⅧ）是人血液中的一种重要的凝血因子，是治疗甲型血友病的特效药。沉淀法是生产FⅧ制剂的传统方法，如甘氨酸沉淀法、聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）沉淀法和盐析沉淀法等，沉淀法具有操作简单、快速、经济的特点，但是仅采用沉淀法获得的FⅧ纯度较低，比活性小于10.0 IU/mg，并且含有大量杂蛋白，临床使用不良反应大，难以满足市场和临床需求。《中华人民共和国药典（2020版）》三部（以下简称“药典三部”）规定FⅧ制品的比活性应不低于10.0 IU/mg[1]。鉴于此，国内学者引入离子交换层析技术纯化FⅧ，不仅可获得较高纯度的FⅧ制品，还能有效去除大部分杂蛋白和化学物质，在很大程度上提高了FⅧ产品的质量[2-4]。本研究采用PEG沉淀结合离子交换层析法制备出一种冻干型FⅧ，该技术能实现较高的回收率和比活性，且产品稳定性和重复性好，适用于规模化生产。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人血浆冷沉淀：国药集团上海血液制品有限公司按《中华人民共和国药典（2020版）》三部和企业制检规程制备，每批次血浆冷沉淀投料量为30 kg。

肝素钠（注射级），上海上药第一生化药业有限公司；PEG 4000，化学纯，国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸、无水氯化钙、磷酸三丁酯（TNBP）、盐酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠，分析纯，江苏省勤奋药业有限公司；枸橼酸钠、蔗糖，药用级，湖南尔康制药股份有限公司；聚山梨酯80（Tween-80），药用级，德国Merck公司；甘氨酸，药用级，天津天药药业股份有限公司；层析介质（Toyopearl DEAE-650M），日本Tosoh公司。

1.2 仪器与设备

HAPRLESS AS-26离心机，日本巴工业株式会社；AKTAprocess蛋白质纯化系统，美国GE公司；STA Compact全自动血凝仪，法国STAGO公司；LC300层析柱，荣捷生物工程(苏州)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 FⅧ的制备工艺流程

FⅧ制备的具体工艺流程如图1所示。

图1 制备FⅧ的工艺流程图

1.3.2 FⅧ制品的检测

1.3.2.1 蛋白含量检测

按照药典三部通则0731第二法Lowry法进行检测。

1.3.2.2 效价检测

用STA Compact全自动血凝仪对制备的FⅧ进行检测，血凝仪的读数乘以稀释倍数即为受检FⅧ的效价。

1.3.2.3 其他相关检测

按照药典三部的相关要求，分别对成品进行物理检查和化学检定。

1.3.3 相关指标的计算

1.3.3.1 成品比活性计算

成品比活性计算公式为FⅧ比活（IU/mg）=FⅧ效价（IU/mL）÷蛋白含量（mg/mL）。

1.3.3.2 FⅧ各级回收率计算

FⅧ各级回收率计算公式为FⅧ各级回收率=（该级总效价÷上样液总效价）×100%。

2 结果与分析

2.1 FⅧ各级回收率

从上样液开始计算，FⅧ洗脱、除菌过滤、冻干和干热病毒灭活后各级回收率计算结果如图2所示，平均值分别为75.66%、66.73%、62.98%和60.45%。由于上样流穿液和洗涤流穿液中可能含有部分FⅧ，且一些结合力较强的FⅧ牢固地吸附在凝胶颗粒上未能被有效洗脱，导致洗脱步骤会有一定的活性损失。除菌过滤操作中部分FⅧ残留在滤器内不能有效回收且除菌过滤压力较大使得FⅧ活性损失。冻干操作虽能使绝大部分蛋白活性保留下来，提高蛋白的稳定性，但其脱水和降温过程均会对FⅧ活性造成影响。干热病毒灭活是对冻干后FⅧ制品在98～100 ℃沸水浴中进行30 min的热处理，能有效灭活非脂包膜病毒，同时也对制品的活性产生了一定的影响[5]。

图2 FⅧ各级回收率结果

2.2 FⅧ成品物理检查

FⅧ外观和复溶时间情况见表1。结果显示，离子交换层析法纯化的FⅧ冻干后外观成型较好，符合药典三部的要求，用灭菌注射用水复溶后，复溶后外观均为无色澄明液体，复溶时间小于30 min。

表1 FⅧ成品物理检查结果

2.3 FⅧ成品化学检定

PEG是前期FⅧ粗制提纯的主要化学试剂，Tween-80和TNBP是S/D灭活剂的主要成分，其作用是破坏含脂质的病毒包膜而使其失去传染性或复制能力，能有效去除HIV、HBV和HCV等脂包膜病毒[5]。化学检定结果如表2所示，3种化学物质平均残留量分别为46.0 μg/mL、3.30 μg/mL和0.043 g/L，均满足药典规定，表明离子交换层析技术能有效控制化学物残留量。

表2 FⅧ成品化学检定结果

2.4 FⅧ成品比活性

比活性是制备FⅧ工艺过程中的关键指标，通过检测FⅧ成品的效价和蛋白含量来计算比活性，结果如表3所示。FⅧ比活性平均值为70.17 IU/mg，SD值为7.07 IU/mg，RSD值为10.08%，该结果与国内某公司的研究结果（69±11）IU/mg相仿[4]。表明该工艺能制备高比活性的FⅧ，且稳定性和重复性较好。

3 结论

本研究釆用PEG沉淀结合离子交换层析法开展3批次连续实验，从人血浆冷沉淀中提取FⅧ。研究中首先分析了洗脱、除菌过滤、冻干和干热病毒灭活工艺的FⅧ活性回收率情况，结果表明从上样液开始计算，各级回收率平均值分别为75.66%、66.73%、62.98%和60.45%。研究中还对FⅧ成品进行了物理检查和化学检定，其结果均符合药典标准。最后对FⅧ比活性进行了分析，其平均值为70.17 IU/mg，RSD值为10.08%。综上所述，本文实验方法不仅能从血浆冷沉淀中提取出高比活性的FⅧ，还能有效去除化学物残留，且工艺稳定可靠，适用于FⅧ的规模化生产。