脱钙前脱脂处理对小鼠足趾组织制片的效果研究

李博宇，王启文，刘英芹

（桂林医学院 智能医学与生物技术学院，广西桂林 541199）

通常动物骨组织制片中，会将皮肤、多余的肌肉和结缔组织剔除，使骨组织充分暴露在脱钙液中。但在小鼠足趾再生实验中需要完整保留软组织，需要精确控制脱钙液的浓度和脱钙时间。如果脱钙方法不恰当，则可能会损伤软组织。因此选择合适的方法非常重要[1-2]。

骨组织中含有大量脂肪，填充于骨髓腔和其他管腔的孔隙中，脂肪的疏水性导致部分化学试剂难以进入骨基质孔隙中[3]。同种异体骨移植实验表明，脂肪去除程度越高的骨移植材料在植入体内后更容易被体液浸润[4]。脱钙效率受溶液浓度、温度、暴露时间和渗透率的影响[5],对组织进行脱脂，去除组织内的脂肪，能使脱钙液更易渗入，从而提高脱钙效率。本文中的小鼠趾骨体积小且被皮肤等软组织包被（末端的第三趾骨被趾甲包裹），软组织中还存在大量脂质，多重防护下，脱钙液难以直接接触骨组织。通过鼠趾脱脂处理，希望能够加快脱钙效率，减少组织在酸中浸润时间，保证染色质量，为小体积且需要保留软组织的骨组织脱钙提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

苏木素染液（Harris），珠海贝索生物技术有限公司；伊红染液（水溶性），珠海贝索生物技术有限公司；甲酸、浓盐酸、二甲苯，分析纯，西陇科学股份有限公司；磷酸缓冲盐粉剂（CC0002），北京雷根生物技术有限公司；无水乙醇，分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；多聚甲醛（C104188），分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯甲烷，分析纯，成都市科隆化学品有限公司；中性树胶100 mL（G8590），北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

YD-6L生物组织冷动台，金华市益迪医疗设备有限公司；YD-6L生物组织包埋机，金华市益迪医疗设备有限公司；YD-335A型电脑切片机，金华市益迪医疗设备有限公司；YD-AB2生物组织摊烤片机，金华市益迪医疗设备有限公司；TKD-TSF生物组织智能脱水机，湖北康强医疗器械有限公司；ECLIPSE 80i高级研究型荧光正立显微镜，日本Nikon公司。

1.3 溶液配制

20%脱钙液：10 mL甲酸，10 mL盐酸，80 mL磷酸盐缓冲盐溶液。

4%甲醛溶液：将40 g多聚甲醛溶解到960 mL蒸馏水中。

磷酸盐缓冲盐溶液：将1袋（重约10 g）的磷酸缓冲盐粉剂溶于1 000 mL蒸馏水。

1.4 实验动物

选择6～8周健康雄性昆明小鼠10只，体重为30～35 g，购自桂林医学院实验动物中心。

1.5 组织制片处理

戊巴比妥钠麻醉处死小鼠后，均从左右后肢取中间第三鼠趾。样品在4%甲醛溶液中浸泡12 h，脱脂组：三氯甲烷脱脂4 h，水洗后脱钙；对照组：直接脱钙。所有组织采用同一种脱钙液，且每隔12 h更换脱钙液。脱脂时间计入脱钙时间（如脱钙24 h是指脱脂4 h，水洗，然后脱钙20 h）。脱钙完成后立即用流水冲洗12 h，再放入脱水机中脱水和浸蜡处理，石蜡包埋，切片厚度为4 μm，常规HE染色，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.6 评价方法

参照表1，在切片阶段观察组织，记录得分；HE染色后镜下观察组织，记录得分。

表1 鼠趾石蜡切片、HE染色评分标准

1.7 数据处理

实验数据均采用IBM SPSS Statistics 26.0统计学分析软件处理，t检验分别比较各脱钙时间3个单项得分（切面完整性、组织平整度、核质对比）和总分（3项得分之和）共4组数据，以P＜0.05表示有统计学意义。计量资料采用均数±标准差（±s）表示。

2 结果与分析

2.1 不同时间脱钙效果

由图1可知，脱脂组整体得分高于对照组，其中脱脂组得分最高点位于24 h，得分为（13.57±1.44）分，最低点位于72 h，得分为（12.63±2.96）分；对照组得分最高点位于36 h，得分为（13.27±1.56）分，最低点位于12 h，得分为（11.00±2.17）分。比较两组各时间段总分，发现脱钙12 h和24 h有显著性差异（P＜0.05）。表明脱脂对短时间内的脱钙作用最为明显，两组间差异随着脱钙时间的增加呈现出减少的趋势。

图1 对照组与脱脂组在不同脱钙时间下的得分

2.2 对切片质量的影响

由图2可知，在切片完整性方面，脱脂组各时间段均可切出完整切片，同组间无显著差异，脱钙12 h切片质量明显优于对照组（P＜0.01）。对照组脱钙12 h切片过程中有砂砾感，特别是第三趾骨被趾甲包裹处，切片时肉眼可见有砂粒状白色粉末，甚至会发生趾甲脱落，伴有第三趾骨部分组织缺损，蜡带也可观察到组织脱落形成的空洞，24 h之后连续切片完整性要明显优于12 h（P＜0.05）。随脱钙时间延长对照组切片质量逐渐上升，两组间差异逐渐减小，脱钙24 h后与脱脂组无明显差异。

图2 对照组与脱脂组在脱钙12 h和72 h单项得分

在组织平整度方面，脱钙12 h对照组、脱脂组在关节处均出现虚影（见图4中A’和B’），组织未处于同一平面，平整度欠佳，对照组36 h后有明显改善（P＜0.05），脱脂组在脱钙24 h即可获得平整度较高的切片（P＜0.05）。通过脱脂加速脱钙，短时间内即可获得质量较高的切片。在脱钙12～72 h时，脱钙时间越长，平整度越好，脱钙12 h与72 h平整度有显著差异（P＜0.001）。

2.3 对HE染色效果的影响

2.3.1 脱钙12 h、72 h苏木素染色结果对比

组织脱钙过度或脱钙不足都会直接影响制片的质量和染色效果[6]。脱钙时间过短或脱钙不充分，则难以得到完整切片。脱钙时间过长会损伤蛋白和核酸，无法着染苏木素和其他碱性材料[7-8]，核质对比度不佳，细胞结构分辨不清。如图3所示，对照组和脱脂组在脱钙处理12 h后，苏木素着色效果较好，色泽鲜艳，细胞核清晰可见，其中脱脂组着色略深于对照组。两组在脱钙处理72 h时，苏木素着色效果变差，细胞核染色较淡。

图3 脱钙12 h和72 h苏木素染色效果比较

2.3.2 脱钙12 h、72 h HE染色结果对比

脱钙12 h，40倍镜下对照组染色均匀，第三趾骨结构有缺损，趾甲脱落（见图4A），HE染色较好，细胞核清晰可见；200倍镜细胞核着色较好，核质对比清晰，但在关节处切面不平，出现虚影（见图4A’）。脱脂组鼠趾边缘着色过深（见图4B），蓝紫色细胞核清晰可见，关节处结构完整；200倍镜细胞核整齐排列清晰可见，胞质对比明显，在关节处出现与对照组相同的虚影（图4B’）。虚影出现的原因可能是脱钙不完全，使骨组织褶皱。

图4 脱钙12 h HE染色效果比较

脱钙72 h，对照组染色过浅，40倍镜下已无法观察到细胞核（见图5A），200倍镜下可看到淡蓝色细胞核，对比度差（见图5A’)。脱脂组染色偏淡，40倍镜下着色较浅（见图5B），200倍镜下可见淡蓝色细胞核，核质对比质量略好于对照组（见图5B’)。相比于脱钙12 h，脱钙72 h时染色质量下降，对比度降低。

图5 脱钙72 h HE染色效果比较

3 结论

脱钙前脱脂处理可以提高鼠趾脱钙效率，对染色有促进作用。脱钙12 h后切片，由于脱钙时间过短，导致脱钙不完全，关节处未处在同一平面，因此脱脂处理的组织，脱钙时间也应不低于24 h。兼顾切片和染色质量的综合考量下，对照组最佳脱钙时间为36～48 h，脱脂组在24～48 h均可保证切片和染色质量。无论是否脱脂处理，脱钙时间建议不要超过48 h。