三维多细胞球体在牙周组织再生中的研究进展

雷笑霄， 闫香珍， 罗礼君

(同济大学附属口腔医院牙周病科，上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，上海 200072)

牙周炎是牙周组织慢性炎症性疾病，其特征是牙龈的反复炎症，牙槽骨、牙周膜等牙周组织被破坏。如不及时治疗，牙周炎将引起牙周附着丧失，形成牙周组织缺损，最终牙齿松动脱落。目前牙周炎的常规治疗包括牙周非手术治疗和手术治疗。这些治疗方法通常可以减缓或阻止疾病进一步发展，但获得牙周组织再生仍是临床难点。新的治疗方法包括引导组织再生术以及各种基于生长因子的疗法等[1]。当牙周缺损较大时，牙周组织再生受限，这可能与牙周组织中干细胞数量减少、功能受损等有关。随着组织工程和干细胞治疗技术的发展，通过干细胞移植促进牙周组织再生，成为新的研究方向，以克服现有疗法的局限性[2]。基于细胞的牙周组织再生策略需要大量种子细胞，传统的二维培养环境异于细胞体内生长环境，所得产物也不同于体内生长细胞，使其难以实际应用于牙周组织再生。近年来研究发现，三维多细胞球体不仅增强了细胞多向分化潜能，还有较强的抗炎能力。由此推测，将牙周再生细胞进行三维培养可提升其干性并促进其在炎症微环境下的牙周再生。

1 干细胞在牙周组织再生中的应用

1.1 牙周组织再生中干细胞的作用

干细胞是牙周组织再生的一个关键因素，在维持牙齿生理功能及牙周组织更新中起到了重要的作用[1]。

理想的干细胞增殖、传代能力强，具有特定的分化潜能或表型；来源可靠，取材简便，性能稳定，能适应受植区的环境，对机体损伤小，无免疫排斥反应等[3]。目前，用于牙周组织再生的细胞有胚胎干细胞和成体干细胞，其中对成体干细胞研究较多。

应用于牙齿再生和牙周修复的干细胞包括: 牙髓干细胞、脱落乳牙干细胞、根尖牙乳头干细胞、牙囊祖细胞(dental follicle cells, DFC)、牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSC)、口腔上皮干细胞、间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)、脂肪干细胞、胚胎干细胞和诱导多能性干细胞等[4-5]。不同干细胞对于牙周组织再生的效果不尽相同，研究表明，牙源性干细胞效果优于非牙源性干细胞，而牙髓干细胞与PDLSC效果相当[4]。

为了明确细胞对牙周组织再生的效能，Yan等[6]对基于细胞治疗策略的牙周组织再生动物实验进行了系统评价，结果表明细胞对牙周组织再生的确有积极作用，其中PDLSC及MSC应用最多，然而只有PDLSC能同时促进牙周膜、牙骨质与牙槽骨的再生。这可能是由于PDLSC中具有多种亚群细胞，而每种细胞亚群保留了不同的特定分化潜能，能够共同促进牙周软硬组织生成。其他研究也发现，PDLSC可通过影响巨噬细胞向M2型极化，促进牙周组织再生[7]；PDLSC在体外表现出血管生成，免疫调节和多系分化能力，是牙周再生理想的候选者[8]。

1.2 细胞应用种类和方式及其优缺点

目前，体外扩增细胞的标准技术是传统的二维贴壁培养。这种培养环境与体内生存环境差距大，培养的细胞生物性能等方面异于体内细胞。首先，在二位环境中细胞被拉伸，缺乏细胞-细胞和细胞-基质相互作用。此外，二维培养的细胞骨架重排，获得人工极性，导致正常生理行为改变。二维培养数次传代后，细胞干性降低[9]。最终细胞的生长趋于单一化，许多生物学性状难以维持，形态和功能发生改变，衰老、多能性降低以及旁分泌能力受损等，难以发挥治疗潜能。故传统体外培养的细胞无法与体内的细胞完全等同。

于是，学者提出三维细胞培养技术。三维培养技术包括将细胞嵌入到生物支架材料中和细胞本身聚集形成多细胞球体[10]。

三维培养的细胞具备以下几点优势: 三维微环境更能保留细胞的生理表型；细胞-细胞产生更好的接触作用；细胞外基质充斥在细胞周围，有利于细胞局部停留；核心部分相对低氧的环境有利于分泌营养因子[11]。但是，三维培养无法对良莠不齐的细胞进行质量异质性筛选。且在尺寸不可控的三维细胞球中，不同部位的细胞营养不均衡，如在细胞球中心的细胞，因缺少营养、低氧和失巢凋亡而衰老、凋亡或变异等。

二维培养与三维培养主要特点比较见表1。

表1 二维培养与三维培养主要特点比较Tab.1 Comparison of the main characteristics of two-dimensional culture and three-dimensional culture

2 三维培养技术

2.1 现有三维培养体系及其局限性

细胞三维培养方法有悬滴法[12]、基于光刻和微图案化技术法[13]、低黏附培养皿法[14]、生物反应器动态悬浮法[15]、微流体法[16]、壳聚糖膜培养法[17]、微孔芯片法[18]等。

尽管上述方法可获得三维多细胞球体，但仍存在局限性。如悬滴法可收获大小均匀的球体，但体积调节受限，平均尺寸相对较小[19]，且产量低；悬浮法虽产量大，并可以控制大小[20]，但是此方法需特殊设备，混合产生的剪切流会损坏细胞；低黏附培养皿法无法控制球体大小；微流体法产生的球体很难收集并进一步分析[21]。未来应寻求一种操作简单、成球效率高、成本低，易于推广的三维多细胞成球法。

微孔芯片法和壳聚糖膜培养法是目前较新的2种三维培养方法。微孔芯片法可以获得均匀并且可控大小的多细胞球体[18]。壳聚糖膜培养法简单易行，无需特殊设备。细胞在壳聚糖膜上先黏附，壳聚糖中的氨基螯合Ca2+，将其表面的钙转移到细胞中，导致细胞运动活跃，细胞-壳聚糖黏附力小于细胞-细胞黏附力，最后细胞自组装成多细胞球体[22-23]。

2.2 壳聚糖的性能及其应用

壳聚糖无毒且可降解，具有独特而有利的特性，如抗微生物[24]、抗肿瘤[25]、抗氧化[24]和止血[26]。壳聚糖用于组织修复或再生的另一优势是易于加工成多种形式，如薄膜，海绵和水凝胶。且其与细胞外基质多糖成分结构相似故具有高度生物相容性。另外，壳聚糖上参与球体形成过程的钙信号相关基因的表达高于非黏附表面上的表达[27]。

3 三维多细胞球体在牙周组织再生中的应用研究

用聚乙二醇标记的微孔芯片培养PDLSC球体，发现其表达MSC标志物，这与单层培养PDLSC相似。与后者相比，PDLSC球体中干性相关因子的表达显著增加；经成骨诱导培养后矿化结节形成能力、碱性磷酸酶活性和成骨相关基因的表达增强。动物模型中也有同样的结果，PDLSC球体处理显著增强小鼠颅骨缺损模型中新骨形成[28]。将人PDLSC和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)或共培养物接种到热敏培养皿上制作细胞片。细胞片以3种不同的组合包裹在制备的人牙根片周围，并将其植入小鼠体内。结果显示，与对照组相比，在术后2、4和8周，实验组出现牙周膜样组织排列，在含HUVEC组中观察到血管腔；且牙周膜再生、牙骨质形成和成骨在第4周和第8周时明显增强[29]。在聚丙烯管中沉淀培养PDLSC球体，与二维培养相比，球体培养显著增加PDLSC抗炎效应和血管生成能力[30]。

本课题组前期用壳聚糖膜法成功培养出PDLSC多细胞球体，细胞在球体内具有良好活性，且该方法具有以下优势: (1) 技术简单，成球效率高，重复性好；(2) 更高的多能性相关基因的表达；(3) 增殖、克隆形成和成骨分化能力增强[31]。因此，这些多细胞球体更适用于组织工程。

4 三维培养细胞促进组织再生机制

基于PDLSC牙周组织再生的一个主要问题是原代培养只产生少量的细胞，在临床应用前需大量扩增。而PDLSC在体外扩增极易老化，且牙周炎症微环境抑制PDLSC增殖和分化，从而降低PDLSC牙周再生能力。牙周再生另一重要因素是血凝块的稳定[32]，血小板合成并释放多种细胞因子和生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和内皮生长因子等[33-34]。

转录因子 Oct4、Sox2和Nanog对维持多能胚胎干细胞分化潜能至关重要[35]，这些干性标志物基因同样存在于成体干细胞中[36]。与单层培养人DFC相比，DFC球体中Sox2、Oct4和Nanog表达显著增加[37]。同时，研究[31]也发现PDLSC球体中Oct4、Sox2和Nanog的表达上升。另有研究表明，三维培养的牙髓干细胞具有优异的多向分化能力[38]。以上结果均证明三维成球培养可增强细胞的多向分化潜能。

此外，多细胞球体可提升抗炎能力[39]，因此更加适合应用于牙周炎症微环境。研究发现，Wnt3a可促进PDLSC的增殖、迁移和成骨分化及牙槽骨再生[40]。与单层培养PDLSC相比，PDLSC球体抗炎相关基因肿瘤坏死因子α诱导蛋白6(tumor necrosis factor α-induced protein 6, TSG6)、环氧合酶2(cyclooxygenase2, COX2)、锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase, MnSOD)表达显著上调[39]。研究发现TSG6与细胞干性及Wnt通路相关: (1) 外源性应用TSG6可以显著提高肝星状细胞干性相关基因的表达[41]；(2) TSG6敲除的MSC增殖能力下降，多向分化能力丧失，Wnt通路受到抑制[42]。MSC球体分泌更多数量和类型除白介素和干扰素外的细胞因子。此外，MSC球体有助于分泌免疫反应相关的蛋白质，包括补体、免疫球蛋白和免疫细胞的众多细胞表面分子，进一步分析发现，MSC球体激活神经活性配体-受体相互作用，触发下游PI3K-Akt信号通路，抑制炎症反应[43]。

多细胞球体血管生成相关基因的表达水平也有提高。PDLSC球体血管生成相关基因(VEGF、bFGF)表达水平较单层培养PDLSC提高[39]。与单层培养PDLSC相比，PDLSC球体和PDLSC与血管内皮细胞共培养球体中VEGF的表达都有所增高[44]。

已有多项研究发现PDLSC球体成骨分化潜能增强。PDLSC球体成骨潜力的增强通过一种Wnt信号通路拮抗剂SFRP3(secreted frizzled-related protein 3)介导的碱性磷酸酶激活来调节[28]；三维培养特异性激活了MAPK和NF-κB信号通路并改善了细胞凋亡效应，以促进MSC的再生潜力[45]。

综上所述，三维培养可以激活Wnt、PI3K-Akt、MAPK和NF-κB通路相关基因，增强细胞干性、多向分化潜能、提升其抗炎能力，并上调多种生长因子和细胞因子。据此推测，三维培养可促进组织再生。

5 展 望

迄今为止，学者们为寻求一种理想的方法来促进牙周组织再生进行了大量的研究。三维多细胞球体有望成为促进牙周组织再生的可行性方法，但目前基于干细胞的牙周再生策略存在瓶颈: (1) 细胞在体外扩增过程中干性衰退，牙周再生能力降低，使其难以在临床推广应用；(2) 牙周炎症微环境会降低PDLSC干性，抑制PDLSC增殖和分化，降低牙周再生能力。近年来研究发现三维多细胞球体不仅增强了细胞多向分化潜能，还提升了抗炎能力。因此，进一步研究PDLSC球体的干性维持、抗炎及免疫调控效应促进牙周组织再生，并探索相关机制，有望为炎症微环境下牙周再生治疗提供新的思路和策略。最后，PDLSC球体应用于牙周再生的安全性及可靠性还需大量动物模型研究和临床试验来证明。