诺丽酵素的化学成分及其抗菌活性研究

况家才，赵 婷，张 斌，余章昕，陈光英

（1.海南师范大学 热带药用资源化学教育部重点实验室，海南 海口 571158；2.海南师范大学 化学与化工学院 海南省热带药用植物化学重点实验室，海南 海口 571158）

诺丽（Morinda citrifoliaLinn）又名海巴戟天、海巴戟，别名Noni，为茜草科（Rubiaceae）海巴戟天属（Morinda）植物，在中国海南岛、台湾岛以及西沙群岛等地有广泛分布。其果实被称为“精力果”，南太平洋地区的波利尼亚人把诺丽果作为食品和保健品已有2000多年的历史。诺丽果主要含有生物碱类、黄酮类、酚类、糖苷类等多种活性成分，部分化合物表现出抗氧化、改善血液循环、镇痛、抗肿瘤等活性[1-3]；Anwar等对诺丽果进行研究，结果表明诺丽果乙醇提取物具有中等的抗氧化活性（IC50为101～250µg/mL）[4]；Adnyana等在四氧嘧啶糖尿病小鼠试验中，诺丽果乙醇提取物（剂量为500 和1000 mg/kg）显示出显著的降糖活性[5]；Jainkittivong等研究表明，诺丽果乙醇提取物具有抗白色念珠菌作用[6]。

由于成熟的果实具有刺激气味且带苦味让人难以下咽，因此目前许多企业将诺丽果发酵成果汁（称为诺丽酵素），并不断地开发成多种口味的果汁进行售卖。诺丽酵素中含有黄酮类、糖苷类、萜类及生物碱类等多种活性成分[7-9]，具有降糖、保肝、抗炎等效果[10]。Horsfal等研究证明诺丽果汁对Sprague-Dawley 糖尿病大鼠具有降血糖活性[11]；采用诺丽果汁治疗牙龈炎和牙周炎的研究表明，诺丽果汁的额外治疗显著降低了牙龈炎症[12]。为了寻找其中新的活性化合物，笔者所在的课题组对诺丽酵素的化学成分进行研究，从中分离得到了11个化合物，分别鉴定为blumenol A（1）、（6R，7E）-9-hydroxy-4，7-megastigmadien-3-one（2）、4-allyl-2-hydroxyphenyl-1-O-β-D-apiosyl-（1→6）-β-D-glucopyranoside（3）、2-methoxy-4-vinylphenylβ-D-apiofuranosyl-（1→6）-β-D-glucopyranoside（4）、4-hydroxyphenethyl-2'-R-hydroxypropanoate（5）、3-羟基-4-甲氧基肉桂酸（6）、trans-4-hydroxy cinnamic acid（7）、对羟基苯丙酸甲酯（8）、p-hydroxy-phenylpropionic acid（9）、3-甲氧基-4-羟基苯乙醇（10）和香草酸（11）。化合物1～2 为紫罗兰酮倍半萜，3～4 为糖苷类化合物，5～11为酚酸类化合物。其中，化合物1～2、5～11为首次从诺丽酵素中分离得到，结构如图1所示。

图1 化合物1～11的结构Figure 1 Structures of compounds 1-11

1 仪器与材料

Bruker AV（400 MHz），瑞士Bruker公司；Agilent 1260液相色谱仪，美国Agilent公司；制备高效液相色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×9.4 mm，5µm）；Sephadex LH-20，瑞士Amersham Blosclences 公司；柱层析硅胶及GF254 薄层板，青岛海洋化工厂。色谱纯乙腈，西陇化工股份有限公司；其余化学试剂均为分析纯。

供试细菌：四联球菌（Micrococcus tetragenus）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

2 提取与分离

将由海南省松吉元桑有限公司提供的诺丽酵素（120 L）依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，得石油醚部位35 g，乙酸乙酯部位89 g。取乙酸乙酯部位89 g 经正相硅胶柱层析，以氯仿-甲醇梯度洗脱，得到7 个组分（Fr.1～7）。

Fr.3组分用硅胶（48～75µm）拌样，以氯仿-甲醇[（30∶1)～(0∶100)，v/v]进行洗脱，得到4个组分Fr.3a～3d。对Fr.3c组分继续用反相硅胶柱以水-甲醇[（100∶0)～(0∶100)，v/v]洗脱，得到Fr.3c1～3c3。Fr.3c1以28%的乙腈-水为流动相经高效液相色谱分离，得到化合物5（15 mg）、6（17 mg）、7（10.3 mg）。Fr.3c2以20%的乙腈-水为流动相经高效液相色谱分离，得到化合物8（10 mg）、9（13 mg）、10（14 mg）、11（12 mg）。

Fr.5 组分首先用凝胶柱以氯仿-甲醇（1∶1）进行洗脱，再以硅胶（48～75µm）拌样以氯仿-甲醇[（30∶1)～(0∶100)，v/v]进行洗脱，得到3个组分Fr.5a～5c。Fr.5b以13%的甲醇-水为流动相经高效液相色谱分离，得到化合物1（15 mg）、2（10 mg）。

Fr.6组分以硅胶（48～75µm）拌样，以氯仿-甲醇[（20∶1)～(0∶100)，v/v]进行洗脱，再继续用凝胶柱以氯仿-甲醇（1∶1）进行洗脱，得到5个组分Fr.6a～6e。Fr.6a以9%的甲醇-水为流动相经高效液相色谱分离，得到化合物3（7 mg）、4（8 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：黄色油状，易溶于氯仿，UV 254 nm下显暗斑。[α]+13.8（c0.1，MeOH），ESI-MSm/z:247.1[M+Na]+，结合1H-NMR 和13C-NMR 确定分子式为C13H20O3。1H-NMR（Acetone-d6，400 MHz）δH:5.86（1H，br.s，H-4），5.85（1H，d，J=2.4，H-8），5.80（1H，dd，J=2.8，1.6，H-8），4.19（1H，m，H-9），2.43（1H，d，J=16.8 Hz，H-2a），2.11（1H，d，J=16.8 Hz，H-2b），1.89（3H，s，H-13），1.21（3H，d，J=6.4 Hz，H-10），1.04（3H，s，H-12），1.01（3H，s，H-11）;13C-NMR（Acetone-d6，100 MHz）δC:197.8（C-3），164.5（C-5），137.0（C-7），129.4（C-8），126.8（C-4），79.4（C-6），67.7（C-9），50.4（C-2），41.8（C-1），24.4（C-12），24.2（C-10），23.4（C-11），19.3（C-13）。以上数据与文献[13]报道的基本一致，故鉴定化合物1为blumenol A。

化合物2：黄色油状，易溶于氯仿，UV 254 nm 下显暗斑。[α]+8.2（c 0.1，MeOH），ESI-MSm/z:231.1[M+Na]+，结合1H-NMR 和13C-NMR 确定分子式为C13H20O2。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δH:5.89（1H，br.s，H-4），5.68（1H，dd，J= 15.4，6.0 Hz，H-8），5.59（1H，dd，J= 15.0，8.8 Hz，H-7），4.34（1H，m，H-9），2.51（1H，d，J=9.2 Hz，H-6），2.33（1H，d，J=16.8 Hz，H-2a），2.08（1H，d，J=16.8 Hz，H-2b），1.90（3H，s，H-13），1.29（3H，d，J=6.4 Hz，H-10），1.02（3H，s，H-11），0.95（3H，s，H-12）;13C-NMR（CDCl3，100 MHz）在δC:199.2（C-3），162.3（C-5），138.7（C-8），126.8（C-7），126.0（C-4），68.3（C-9），55.4（C-6），47.4（C-2），36.2（C-1），28.0（C-12），27.3（C-11），23.8（C-10），23.7（C-13）。以上数据与文献[14]报道的基本一致，故鉴定化合物2为（6R，7E）-9-hydroxy-4，7-megastigmadien-3-one。

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇，UV 254 nm 下显暗斑。[α]-28.3（c0.1，MeOH），ESI-MSm/z:467.2[M+Na]+，结合1H-NMR 和13C-NMR 确定分子式为C20H28O11。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH:7.05（1H，d，J=8.2 Hz，H-6），6.63（1H，d，J=2.2，H-3），6.57（1H，dd，J=8.4，2.2 Hz，H-5），5.90（1H，m，H-8），5.01（2H，m，H-9），4.86（1H，d，J=3.2 Hz，H-1''），4.59（1H，d，J=7.2 Hz，H-1'），3.90（1H，d，J=9.4 Hz，H-4''a），3.88（1H，d，J=9.2 Hz，H-6'a），3.78（1H，d，J=3.0 Hz，H-2''），3.61（1H，d，J=9.4 Hz，H-4''b），3.47（1H，dd，J=10.0，6.0 Hz，H-6'b），3.47（1H，dd，J= 7.8，6.4 Hz，H-3'），3.36（2H，s，H-5''），3.27（1H，t，J= 9.0 Hz，H-2'），3.27（1H，m，H-5'），3.23（2H，m，H-7），3.11（1H，m，H-4'）;13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC:146.7（C-2），143.8（C-1），137.9（C-8），134.6（C-4），119.3（C-6），117.0（C-5），116.0（C-3），115.5（C-9），109.4（C-1''），102.7（C-1'），78.8（C-3''），76.0（C-2''），75.8（C-5'），75.7（C-3'），73.3（C-2'），73.3（C-4''），70.2（C-4'），67.8（C-6'），63.2（C-5''），40.6（C-7）。以上数据与文献[15]报道的一致，故鉴定化合物3 为4-allyl-2-hydroxyphenyl 1-O-β-D-apiosyl-（1→6）-β-D-glucopyranoside。

化合物4：白色粉末，易溶于丙酮，UV 254 nm 下显暗斑。[α]-19.5（c0.1，MeOH），ESI-MSm/z:481.2[M+Na]+，结合1H-NMR 和13C-NMR 确定分子式为C21H30O11。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH:7.00（1H，d，J=8.4 Hz，H-6），6.68（1H，dd，J=8.2，1.6 Hz，H-5），6.63（1H，s，H-3），5.94（1H，m，H-8），5.09（2H，m，H-9），4.81（1H，d，J= 3.2 Hz，H-1''），4.79（1H，d，J= 7.8 Hz，H-1'），3.88（1H，d，J= 9.0 Hz，H-4''a），3.86（1H，d，J=9.2 Hz，H-6'a），3.85（1H，d，J=9.4 Hz，H-6'b），3.73（1H，d，J=8.0 Hz，H-2''），3.58（1H，d，J=9.4 Hz，H-4''b），3.57（2H，s，H-5''），3.47（3H，s，H-2-OMe），3.43（1H，d，J=12.0 Hz，H-3'），3.29（1H，d，J=6.8 Hz，H-2'），3.27（1H，m，H-5'），3.21（2H，m，H-7），3.08（1H，m，H-4'）;13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC:148.9（C-2），145.0（C-1），137.9（C-8），133.6（C-4），120.5（C-5），115.7（C-6），115.6（C-1''），113.0（C-9），109.3（C-3），100.5（C-1'），78.8（C-3''），76.8（C-5'），75.9（C-2''），75.5（C-3'），73.3（C-4''），73.2（C-4'），67.7（C-2'），67.7（C-6'），63.2（C-5''），55.7（OMe-2），38.51（C-7）。以上数据与文献[16]报道的一致，故鉴定化合物4为2-methoxy-4-vinylphenylβ-D-apiofuranosyl-（1→6）-β-D-glucopyranoside。

化合物5：黄色油状，易溶于丙酮，UV 254 nm下显暗斑。[α]+2.4（c0.1，MeOH），ESI-MSm/z:233.1[M+Na]+，结合1H-NMR和13C-NMR确定分子式为C11H14O4。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δH:9.24（1H，s，4-OH），7.03（2H，d，J= 8.4 Hz，H-2，6），6.68（2H，d，J= 8.4 Hz，H-3，5），5.32（1H，d，J= 4.0 Hz，2'-OH），4.18（2H，ddd，J= 3.6，1.8，3.8，Hz，H-8），4.08（1H，q，J= 5.6 Hz，H-2'），2.77（2H，t，J= 7.0 Hz，H-7），1.18（3H，d，J=6.8 Hz，H-3'）;13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δC: 175.0（C-1'），156.4（C-4），130.2（C-2，6），128.2（C-1），115.6（C-3，5），66.4（C-2'），65.3（C-8），34.0（C-7），20.9（C-3'）。以上数据与文献[17]报道的基本一致，故鉴定化合物5 为4-hydroxyphenethyl-2'-R-hydroxypropanoate。

化合物6：无色针状结晶，易溶于甲醇，UV 254 nm 下显暗斑。ESI-MSm/z: 217.0 [M + Na]+，结合1HNMR 和13C-NMR 确定分子式为C10H10O4。1H-NMR（MeOD，400 MHz）δH:7.59（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），7.17（1H，d，J=2.0 Hz，H-2），7.06（1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6），6.81（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.31（1H，d，J=16.0 Hz，H-8），3.89（3H，s，OMe-4）;13C-NMR（MeOD，100 MHz）δC:171.1（C-9），150.5（C-4），149.4（C-3），146.8（C-7），127.8（C-1），124.0（C-6），111.7（C-2），116.5（C-8），116.0（C-5），56.4（OMe-4）。以上数据与文献[18]报道对照基本一致，故鉴定化合物6 为3-羟基-4-甲氧基肉桂酸。

化合物7：黄色油状，易溶于丙酮，UV 254 nm 下显暗斑。ESI-MSm/z:187.0[M+Na]+，结合1H-NMR 和13C-NMR 确定分子式为C9H8O3。1H-NMR（Acetone-d6，400 MHz）δH:7.61（1H，d，J=16.0 Hz，H-8），7.54（2H，d，J=8.0 Hz，H-2，6），6.90（2H，d，J=6.0 Hz，H-3，5），6.34（1H，d，J=16.0 Hz，H-7）;13C-NMR（Acetone-d6，100 MHz）δC: 168.3（C-9），160.3（C-4），145.5（C-8），130.7（C-2，6），126.9（C-1），116.5（C-3，5），115.6（C-7）。以上数据与文献[19]报道的基本一致，故鉴定化合物7 为trans-4-hydroxy cinnamic acid。

化合物8：无色油状，易溶于丙酮，UV 254 nm 下显暗斑。ESI-MSm/z:203.1[M+Na]+，结合1H-NMR 和13C-NMR 确定分子式为C10H12O3。1H-NMR（Acetone-d6，400 MHz）δH: 6.92（2H，d，J= 8.4 Hz，H-2，6），6.62（2H，d，J= 8.4 Hz，H-3，5），3.47（3H，s，-OMe），2.67（2H，t，J= 7.6 Hz，H-8），2.42（2H，t，J=7.6 Hz，H-7）;13C-NMR（Acetone-d6，100 MHz）δC: 173.5（C-9），156.6（C-4），132.4（C-1），130.1（C-2、6），116.0（C-3，5），51.5（-OMe），36.6（C-7），30.8（C-8）。以上数据与文献[20]报道的基本一致，故鉴定化合物8 为对羟基苯丙酸甲酯。

化合物9：黄色油状，易溶于丙酮，UV 254 nm 下显暗斑。ESI-MSm/z:189.1[M+Na]+，结合1H-NMR 和13C-NMR 确定分子式为C9H10O3。1H-NMR（Acetone-d6，400 MHz）δH: 7.07（2H，d，J= 8.0 Hz，H-2，6），6.75（2H，d，J=7.6 Hz，H-3，5），2.81（2H，t，J=7.6 Hz，H-8），2.55（2H，t，J=7.6 Hz，H-7）;13C-NMR（Acetone-d6，100 MHz）δC:173.5（C-9），155.7（C-4），131.8（C-1），129.2（C-2，6），115.1（C-3，5），35.6（C-8），29.9（C-7）。以上数据与文献[21]报道对照基本一致，故鉴定化合物9 为p-hydroxy-phenylpropionic acid。

化合物10：白色油状物，易溶于氯仿，UV 254 nm 下显暗斑。ESI-MSm/z:191.1[M+Na]+，结合1H-NMR和13C-NMR 确定分子式为C9H12O3。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δH: 6.86（1H，d，J= 8.0 Hz，H-5），6.75（1H，dd，J=7.6 Hz，H-6），6.55（1H，d，J=2.0 Hz，H-2），3.89（3H，s，-OMe），3.84（2H，t，J=6.4 Hz，H-8），2.82（2H，t，J=6.4 Hz，H-7）;13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δC:146.7（C-3），144.4（C-4），130.4（C-1），121.8（C-6），111.7（C-2），114.6（C-5），64.0（C-8），56.1（-OMe），38.9（C-7）。以上数据与文献[22]报道的基本一致，故鉴定化合物10 为3-甲氧基-4-羟基苯乙醇。

化合物11：无色针晶，易溶于甲醇，UV 254 nm 下显暗斑。ESI-MSm/z:191.0[M+Na]+，结合1H-NMR和13C-NMR 确定分子式为C8H8O4。1H-NMR（MeOD，400 MHz）δH:7.56（1H，br.s，H-2），7.55（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），6.84（1H，d，J= 9.6 Hz，H-5），3.88（3H，s，OMe）;13C-NMR（MeOD，100 MHz）δC: 170.0（C-7），152.6（C-3），148.6（C-4），125.3（C-6），123.0（C-1），115.8（C-5），113.7（C-2），56.4（-OMe）。以上数据与文献[23]报道的基本一致，故鉴定化合物11 为香草酸。

4 抗菌实验

将5 种致病菌接种于肉汤培养基中，置于37℃培养基中培养8～10 h 后稀释[稀释梯度为(1∶500)～(1∶1 000）]备用。采用微量稀释法，将稀释后的含菌培养液分别定量加至96孔板的第一排各孔中，然后将各样品分别加入至各列孔中，单个化合物浓度范围是0.312 5～20.000 0µg/mL，以环丙沙星作为阳性对照，用2倍浓度递减稀释的方法对96孔板进行逐行稀释。将96孔板置于恒温培养箱中37 ℃恒温培养8～10 h，MIC定义为孔板内明显抑制细菌生长的最低样品浓度。

研究结果表明，化合物2对蜡状芽孢杆菌显示出较弱的抑制活性，MIC值为2.5µg/mL（阳性对照环丙沙星MIC值为0.625µg/mL）；其他化合物的MIC值均大于20µg/mL，未显示出明显抗菌活性。

5 结论

本研究运用各种色谱技术对诺丽酵素乙酸乙酯部位的化学成分进行了研究，从中分离鉴定了11个化合物，化合物1～2及5～11均为首次从诺丽酵素中分离得到。采用微量稀释法对所有化合物进行了抗菌活性测试，结果显示化合物2对蜡状芽孢杆菌显示出较好的抑制活性，MIC值为2.5µg/mL，其他化合物未显示出明显抗菌活性。本研究为诺丽酵素的进一步开发利用奠定了一定的理论基础，为诺丽酵素的品质评价和基于诺丽果的产品开发提供了依据。