固相萃取净化-离子色谱法测定不同生长期新鲜烟叶中的7种无机阴离子

刘 欣 岳艳丽 黄海涛 曾婉俐 许 永孔维松 杨叶昆 米其利 李 晶*

(1.云南中烟工业有限责任公司 技术中心，昆明 650106；2. 云南民族大学 民族医药学院，昆明 650031)

无机阴离子广泛存在于烟草中，对烟草生长过程中的生理代谢具有重要作用，也影响着烟叶的品质[1-2]，例如NO2-与NO3-和烟株氮代谢相关，与生长发育有直接联系，例如Cl-与卷烟的燃烧性有负面影响；SO42-、PO43-不仅与烟叶生理生长具有重要的影响，还与烟叶品质有直接关联[3-5]。对于烟叶中的无机阴离子的检测，我国烟草行业还没有统一的标准方法，存在不同无机离子采用不同方法的情况，例如：SO42-的测定主要有硫酸钡比浊法、重量法和沉淀滴定法等，NO3-、Cl-则采用连续流动分析法，以上方法均存在无法同时分析多种无机阴离子，且操作复杂，灵敏度不理想等缺点[6-8]。

离子色谱(Ion Chromatography，IC)法是利用被测物质的离子性进行分离和检测的液相色谱方法[9-11]，目前，离子色谱由于其对于离子态物质分析检测的独特优势，以及操作简便，灵敏度高，精密度高的特点已经广泛应用于食品[12-13]、环境[14-16]、医药[17-18]、烟草[19-20]等多个领域，可为烟草中无机离子的检测提供分析手段；而离子色谱法由于其分离检测的特殊性，针对复杂基质都会采用净化手段来保障检测的顺利进行，固相萃取净化就是其中一种有效的方法[21-22]，目前通过固相萃取净化，离子色谱分析不同生长期新鲜烟叶中的无机阴离子的报道还较少。

本研究拟建立离子色谱法测定烟叶中重要无机阴离子，利用固相萃取的方式进行样品净化，通过比较分析不同生长时期的烟叶中无机阴离子的变化，可以为无机阴离子对烟叶生长发育的影响提供检测方法和数据支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

7种(F-、Cl-、Br-、NO2-、NO3-、SO42-、PO43-)无机阴离子色谱混合标准溶液(1 000 μg/mL，购自国家有色金属及电子材料分析测试中心)，氢氧化钠(分析纯，购于四川西陇科学有限公司)，实验用水均为超纯水，甲醇购于美国Merck公司；63个烟叶样品为云南中烟工业有限责任公司技术中心(昆明)提供，含苗期样品21个，现蕾期样品21个，成熟期样品21个。

ICS-5000型离子色谱仪(美国DIONEX公司)，AERS 500阴离子抑制器(4 mm)，阴离子色谱柱：AS11-HC(4 mm×250 mm)，含相同规格阴离子保护柱；固相萃取小柱RP 1.0cc(希波氏)，SB2200T超声波清洗器(上海科导超声仪器公司)，Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2 实验条件

1.2.1 溶液配制

7种无机阴离子标准溶液的配制(10 μg/mL)：准确移取1 000 μg/mL混合标准溶液0.1 mL至10 mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，混匀，4 ℃下保存；使用时，移取不同量的标准溶液，用超纯水稀释成所需浓度的标准工作液。

1.2.2 离子色谱条件

色谱柱：AS11-HC(4 mm×250 mm)，含相同规格阴离子保护柱；流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量25 μL，流动相KOH(具体浓度通过自动淋洗液发生器调节)，梯度洗脱程序为见表1，检测时间40 min，抑制器电流65 mA，检测方式为电导检测。

表1 离子色谱梯度洗脱程序

1.2.3 样品前处理

取新鲜烟叶样品，经冻干机冻干，用粉碎机加工至粉末后分装备用。

称取试样0.1 g(精确至0.000 1 g)置于100 mL三角锥瓶中，加入25 mL NaOH(0.1 mol/L)，超声仪中提取40 min，萃取液以5 000 r/min离心5 min，取上层清液，备用。

取活化后的固相萃取小柱(依次通过5 mL甲醇、5 mL水，吹干)，连接上0.22 μm离子色谱专用微孔滤膜，取3～4 mL上清液缓慢过固相萃取柱及微孔滤膜，过滤前1 mL滤液弃去，后续滤液收集在色谱瓶中，等待上机测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

AS11-HC是离子交换容量较高的一类离子色谱柱，常用来分离分析不同价态的无机阴离子。分别用10、20、30 mmol/L KOH进行等度淋洗7种阴离子，发现10 mmol/L KOH对于高价态的SO42-、PO43-洗脱能力不够强，且SO42-、PO43-峰形变宽变矮，不利于分析；20 mmol/L KOH 分离条件下，F-、Cl-、Br-、NO2-、NO3-分离度不理想，对于实际样品来说不利于定量检测；30 mmol/L KOH由于洗脱能力较强，但是也导致了一价无机阴离子的分离不理想。因此本研究考虑采用梯度洗脱的方法来分离不同价态、不同离子交换能力的无机阴离子，由于梯度起始洗脱能力较弱，可以将一价无机阴离子较好地分离，而到了离子交换能力较强的多价态离子的时候，迅速提高洗脱浓度，有利于SO42-、PO43-离子的有效洗脱与分离，经过优化，确定的梯度淋洗程序为：0～10 min，10 mmol/L KOH保持不变；10～25 min，10 mmol/L递增至30 mmol/L KOH；25～30 min，30 mmol/L KOH还原至初始状态；30～40 min，保持10 mmol/L KOH以平衡色谱柱。在此分离程序下，7种离子可以较好地得到分离，峰形较为理想，分离度佳。色谱分离图见图1。

图1 无机阴离子标准样品色谱分离图Figure 1 Chromatographic separation chart of inorganic anions standard samples.

2.2 样品前处理优化

2.2.1 提取溶剂优化

分析烟叶中无机阴离子时，文献中提到碱性环境可以更好地提取出无机阴离子，而且碱性的溶剂也较为适应离子色谱分离系统，本研究分别考察了水、0.05 mol/L NaOH水溶液、0.1 mol/L NaOH水溶液、0.5 mol/L NaOH水溶液、1.0 mol/L NaOH水溶液对同一烟叶样品的提取效果，以提取无机阴离子的峰面积为考察对象，图2发现0.1 mol/L NaOH水溶液提取条件下，7种无机阴离子的峰面积最高，因此选择0.1 mol/L NaOH水溶液为实验提取试剂。

图2 不同提取溶剂浓度对提取效率的影响Figure 2 The effect of different solvent on the extracion efficiency.

2.2.2 提取时间优化

一定时间的提取可以有效地将烟叶中的无机阴离子转移到提取液中，实验考察了不同时间对提取效果的影响，主要对比了提取时间分别为10、20、40、60 min的提取结果，以无机阴离子的峰面积为考察对象，发现当提取时间到40 min的时候，提取结果趋于最大，提取时间再加大也没有明显的升高。为了兼顾提取效率和分析效率，故选择提取时间为40 min。

2.2.3 固相萃取柱优化

烟叶中含有大量的脂类、色素、糖类、氨基酸、蜡质以及其他纤维素等成分，对于无机阴离子分析具有较大的干扰，尤其是脂类、蜡质和色素类物质，由于其亲酯性，可能会造成色谱柱的污染，甚至会导致不可逆的堵塞，因此在进行烟叶中无机阴离子分析的时候，一般都不采用直接进样，而是选择对样品进行前处理净化。本实验分别对比了RP1.0cc、C18300 mg、C18500 mg、HLB四种固相萃取小柱对无机阴离子的净化效果及回收率，结果见图3。结果表明利用RP1.0cc的净化效果最佳，7种无机阴离子的回收率均大于96.5%，四种固相萃取小柱对七种无机阴离子的净化效果呈现RP1.0cc>C18300 mg>HLB>C18500 mg的趋势，因此，选择RP1.0cc固相萃取小柱作为烟叶样品的净化柱。

图3 不同固相萃取柱的净化效果对比Figure 3 Comparison results for cleanup with different SPE columns.

2.3 方法验证结果

2.3.1 方法线性关系、检出限和定量限

通过标准储备溶液逐级稀释，配制一系列标准工作溶液(0.10、0.50、1.0、2.0、5.0 μg/mL)，采用选定色谱条件对7种无机阴离子的系列标准溶液进行测定，以各组分峰面积为纵坐标(y)，对应各组分质量浓度为横坐标(x)绘制标准曲线，得回归方程及相关系数，计算当信噪比S/N=3和S/N=10时所对应的标准检出限和定量限，结果见表2。

表2 7种无机阴离子的回归方程、回归系数、检出限和定量限

结果可知，7种无机阴离子在0.10～5.0 μg/mL范围内具有较好的线性(r>0.996)，检出限在0.01～0.04 μg/mL，定量限在0.04～0.14 μg/mL。

2.3.2 加标回收和精密度实验

对新鲜烟叶样品中的7种无机阴离子进行测定，并在前处理前添加一定量(高、中、低 3 个浓度水平)相对应的标准溶液，连续进样5次，测定无机阴离子的重现性，结果见表3。7种无机阴离子的加标回收率为96.3%～102%，相对标准偏差在2.7%～4.8%，可见本方法测定烟叶中的7种无机阴离子的准确度和精密度满足分析要求。

表3 七种无机阴离子的加标回收率和精密度

2.4 实际样品分析

对本单位提供的新鲜烟叶样品(含苗期样品、现蕾期样品、成熟期样品)按照实验方法进行检测，结果见图4和表4(F-、NO2-、Br-均未检出，未列在表中)。

图4 实际样品无机阴离子成熟期的色谱分离图(峰如图1)Figure 4 Chromatographic separation diagram of inorganic anion maturity period of actual sample (Peaks：the same as Figure 1).

从表4 中可以发现，Cl-在整个烟叶生长发育期间变化较大，苗期时含量最高，现蕾期逐渐下降，成熟期最低；NO3-也呈现的是同样规律，这主要是因为Cl-和NO3-在烟叶生长过程中与生长发育影响较大，烟叶生长主要为碳氮代谢，因此在苗期时以生长为主，需要累积大量的营养元素以便于进行植株的长大；PO43-呈现的也基本是这个规律，苗期适合生长时，累积较多的离子，而到了成熟期，烟叶落黄，基本的物质基础稳定；而SO42-则呈现出现蕾期普遍较高，而到了成熟期则有稍微下降，这有可能与成熟期烟叶衰老有关。从无机阴离子的变化规律来看，无机阴离子与烟叶生长发育关系密切，可以为烟叶的品质与生长提供重要的数据支持。

表4 实际新鲜烟叶样品中无机阴离子含量分析

3 结论

建立了固相萃取净化-离子色谱测定新鲜烟叶中的无机阴离子的方法，该方法前处理简单，便于烟叶净化，检测灵敏度高，色谱分离度理想，7种无机阴离子的检出限在0.01～0.04 μg/mL，定量限在0.04～0.14 μg/mL，各分析目标物在0.10～5.0 μg/mL范围内线性较好，7种无机阴离子的加标回收率为96.3%～102%，相对标准偏差RSD值为2.7%～4.8%，精密度与准确度可满足不同生长期烟叶中无机阴离子测定的要求。本研究表明，固相萃取净化-离子色谱法可用于新鲜烟叶样品中多种无机阴离子的含量检测与监测，可为不同生长期烟叶中无机阴离子的分析提供可靠分析方法。