升阳益胃汤对慢性胃炎小鼠胃组织Wnt2、β-catenin蛋白表达的影响

迪丽娜尔·牙生，符雪月，曾晓铃，郭春荣，王慧雯，董 璐，郑小宇，陈 丹，孙勇新，孙祝美

(1上海中医药大学·上海 201203；2复旦大学附属中山医院·上海 200032)

慢性胃炎是发病率较高的慢性病,且伴随着萎缩与肠化生的出现，检出率与胃癌的发生呈正相关[1]。中国是胃癌高发国家，慢性胃炎作为胃癌最常见的癌前疾病，其患病率一直处于较高水平[2]。慢性胃炎是一种多步骤、进行性和终身的炎症，目前已被学界广泛接受的慢性胃炎演变模型为：正常胃黏膜→浅表性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→肠型胃癌[3-4]。因此，慢性胃炎的预防和诊治越来越受到人们的关注。Wnt信号通路与“炎癌转化”密切相关。Wnt/β-catenin信号通路最常见功能主要是胚胎发育和癌症，但也参与成年动物的正常生理过程。研究发现Wnt/β-catenin信号通路中存在多个与胃癌及癌前病变发生、发展机制相关的作用靶点[5]。

升阳益胃汤来源于李东垣《脾胃论》的《内外伤辨惑论》，为“肺之脾胃虚”代表方[6]。据相关研究显示，升阳益胃汤治疗慢性胃炎临床疗效理想，能保护慢性胃炎大鼠胃黏膜，提高机体免疫力，使黏膜得以修复，还可以调控信号通路改善胃黏膜萎缩状态[7-8]。

本实验在以往研究的基础上，观察升阳益胃汤对慢性胃炎小鼠胃组织Wnt信号通路中的β-catenin和Wnt2蛋白表达的影响，为进一步研究提供前期实验室基础。

1 材料

1.1 实验动物 健康雄性昆明种小鼠40只，9周龄，体质量(25±0.9)g，由上海中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：PZSHUTCM201030015,饲养于清洁级环境中，温度控制在20 ℃～26 ℃，相对湿度控制在40%～70%。

1.2 药物与试剂 升阳益胃汤方的组成：黄芪30 g，半夏9 g，党参10g，炙甘草10 g，独活10 g，防风10 g，白芍30 g，羌活10 g，橘皮12 g，茯苓30 g，柴胡10 g，泽泻10 g，炒白术1 0g，黄连6 g，加水浸泡1 h，头煎加水为总药量的10倍，二煎加水为总药量的4倍，取汁去渣，合并两次药汁，蒸发浓缩至含生药1 g/mL，密封在无菌量瓶中备用。氢氧化铝：拜耳医药保健有限公司。2%水杨酸钠溶液：国药集团有限公司，货号20200429；WNT2 抗体：Proteintech公司，货号66656-1-lg；β-Catenin抗体：Proteintech公司，货号17565-1-AP。

1.3 主要仪器 生物显微镜：莱卡仪器有限公司；RM2135 石蜡切片机：莱卡仪器有限公司；IX71荧光显微镜：Olympus。

2 实验方法

2.1 动物分组、造模与给药 将小鼠适应性喂养1 周，随机分为正常组、模型组、升阳益胃汤组、西药组，每组各10只。 以2%水杨酸钠2 mL每天灌胃，前3 周正常饮食，后3 周单日禁食，双日足量进食，结合饥饿饱餐因素，共6 周成模[9]。中药组灌胃给予升阳益胃汤剂(10 g/kg)；正常组、模型组分别灌胃等量的生理盐水，西药组灌胃氢氧化铝混悬液(0.33 mg/kg)[10]，每天1 次。连续给药30 d。

2.2 观察指标

2.2.1 胃组织病理形态学观察 末次给药后，禁食24 h，打开腹腔，取出全胃，沿胃大弯剪开，取胃组织，放入4%多聚甲醛，脱水、透明石蜡包埋，切片(5 μm)，常规HE染色，光镜下观察胃组织病理形态学变化。

2.2.2 免疫荧光法检测胃组织Wnt2、β-catenin表达 处死小鼠后快速取胃组织，投入液氮快速冷冻，冰冻切片，片厚15 μm，Wnt2一抗：1∶200(兔抗大鼠)4 ℃冰箱过夜，二抗，1∶400，荧光标记的抗兔的抗体，室温，孵育1 h；β-catenin一抗：1∶1 000(兔抗大鼠)，37 ℃，孵育2 h，二抗，1∶500，荧光标记的抗兔的抗体，37 ℃，孵育1 h。贴片封片，荧光显微镜观察并进行定量分析。

3 结果

3.1 各组小鼠胃组织病理学变化 胃组织HE染色结果显示：正常组胃黏膜完整，无炎性细胞浸润；模型组胃黏膜变薄，腺体萎缩、减少，排列紊乱，有炎性细胞浸润；升阳益胃汤组胃黏膜腺体病变减轻，排列较整齐，腺体数目增多；西药组胃黏膜腺体萎缩较明显，排列较为松散，腺体数目较少，有少量炎性细胞，与正常组胃黏膜差别明显。见图1。

图1 各组小鼠胃组织病理变化(HE，×100)

3.2 各组小鼠胃组织Wnt2和β-catenin蛋白表达检测结果 模型组小鼠胃组织Wnt2、β-catenin荧光强度较正常组显著增强；升阳益胃汤组小鼠胃组织Wnt2、β-catenin荧光表达强度低于模型组但高于正常组；西药组小鼠胃组织Wnt2、β-catenin荧光表达强度接近于模型组。见图2～图3，表1。

图2 各组小鼠胃组织Wnt2蛋白表达检测结果(免疫荧光，×200)

图3 各组小鼠胃组织β-catenin蛋白表达检测结果(免疫荧光，×200)

表1 各组小鼠胃组织Wnt2和β-catenin蛋白表达的平均光密度比较

4 讨论

中医学中将慢性胃炎的病机分为肝胃气滞证、肝胃郁热证、脾胃虚弱证、脾胃湿热证、胃阴不足证、胃络瘀血证六型[11]；但均以脾胃虚弱为慢性胃炎的病理基础，贯穿整个疾病的始终[12]。升阳益胃汤有升清降浊之效，补中有散，发中有收，对慢性胃炎证属脾胃虚弱患者疗效显著[13]。

Wnt信号途径参与细胞信号启动、分子传递、靶基因转录、表达等多个重要环节。Wnt信号通路对于肿瘤干细胞的增殖、分化和转移起到调节作用，已在多种肿瘤干细胞中得到证实[14]。目前针对胃癌的Wnt信号通路的研究主要集中在β-catenin、Wnt2和c-myc基因表达等几个环节[15]。β-catenin和c-myc基因蛋白的过表达与胃癌和胃的癌前病变密切相关。Wnt信号通路在慢性胃炎患者及胃癌患者发病中具有重要意义[14]。慢性胃炎作为胃癌的发展过程中的重要一环，在疾病处于慢性胃炎阶段对Wnt信号通路传导进行研究，可提早干预，预防炎癌转化。

本实验通过胃组织病理学观察表明升阳益胃汤能有效治疗胃腺体萎缩，减轻胃组织炎症细胞浸润情况，效果比西药组明显。免疫荧光测定结果发现，与正常组比较，模型组胃组织β-catenin和Wnt2表达明显增强；与模型组比较，升阳益胃汤组胃组织β-catenin和Wnt2表达明显减弱(P<0.05)。表明β-catenin和Wnt2表达增加影响慢性胃炎的进展，加重其炎症反应及腺体的萎缩；升阳益胃汤有良好的调节β-catenin和Wnt2失调的作用，可以使其调节至正常水平，从而有效地治疗慢性胃炎，并及时阻断其“炎癌转化”。

综上，升阳益胃汤能有效改善慢性胃炎小鼠胃组织病理变化，减轻胃组织炎症反应，并可以调节胃组织β-catenin和Wnt2表达。初步推断升阳益胃汤对慢性胃炎小鼠Wnt信号通路的有一定影响，为进一步研究“炎癌转化”的阻断提供基础。