脓毒症动物模型的制备方法及影响因素

李 潇, 颜海鹏, 肖政辉

(南华大学儿科学院,湖南省儿童医院重症医学科,长沙 410007)

脓毒症（sepsis）是宿主对感染的反应失调而引起的危及生命的器官功能障碍［1］。全球流行病学调查数据显示，脓毒症和严重脓毒症住院病死率分别为17%和26%；国内多项流行病学调查结果也与之相似，该病是困扰重症监护病房医生的棘手问题之一［2-3］。脓毒症病程受多种因素的影响。为了更好地研究脓毒症的病理机制，寻找更加合理的临床诊疗措施，学者们尝试建立各种脓毒症动物模型以模拟人类脓毒症的病程。然而脓毒症的临床前动物模型很难完全复制临床上人类脓毒症的复杂性，并受到多种因素的影响和制约，现将这些因素综述如下。

1 脓毒症模型的建立方法

结合近些年研究可知，现有的脓毒症动物模型制备方法大致分为四类：（1）注射外源性毒素模型；（2）注射外源性活菌模型；（3）腹腔感染模型；（4）腹腔外脓毒症模型。其中前三种最为常用。

1.1 注射外源性毒素模型

向动物体内注射外源性毒素可建立脓毒症动物模型。例如内毒素或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可诱导机体产生炎性因子，通过介导适应性免疫或产生放大的级联反应，促使全身炎性反应发生。可通过静脉、腹腔等不同途径向动物体内输注LPS，根据剂量和方法不同，分为小剂量一次性输注、小剂量持续输注和大剂量一次性输注。小剂量单次输注LPS，引起宿主的器官功能损伤较轻，自愈率较高。大剂量单次输注LPS 通常会导致心输出量降低，血管阻力正常化或增加，与脓毒症早期高排低阻改变（即全身血管阻力下降，并伴有高心排血量）不符，引起的宿主炎性反应过重，死亡率过高，且致死的原因非脓毒症而是毒血症，与研究目的不符［4］。持续小剂量输注可较好地模拟人类早期高动力和晚期低动力的变化，同时伴有免疫系统的激活，能达到与临床脓毒症相似的死亡率，适于研究抗炎复合物如炎性小体的作用以及炎性级联反应的激活机制。但注射LPS 导致细胞因子短期急速升高，与人类脓毒症病程中产生低而持久可检测的细胞因子水平不符，有一定局限性［5］。

1.2 注射外源性活菌模型

脓毒症是细菌及其细胞壁成分LPS 释放入血导致的全身炎性反应。通过腹腔或静脉注射细菌如大肠埃希菌，能引起机体炎性介质如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）和白细胞介素（interleukin，IL）-1β 快速升高，产生的宿主反应与毒素中毒模型相似，且腹腔内给药产生的炎性反应较静脉给药途径减弱。输注外源细菌可导致弥散性血管内凝血，并参与微血管内皮细胞的活动，扰乱抗凝机制，同时可引起低血压休克，适于研究宿主对病原体的反应机制，探讨针对组织因子及其受体途径的干预方法［5-6］。但该模型缺少类似于临床脓毒症的感染源，且脓毒症通常是多菌性的，单一菌株的使用不能很好地反映脓毒症的临床表现。

1.3 腹腔感染模型

腹腔感染是脓毒症患者最常见的感染源，且腹腔感染模型操作简便，可重复性高，得到了广泛应用。有研究发现，64%的高被引脓毒症动物相关研究使用了盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture，CLP）［7］。CLP 模型通过将盲肠结扎穿孔，使腹腔内少量持续溢入混有多种细菌的肠内容物，重现了多菌性腹膜炎的临床特点，同时可呈现出促炎和抗炎免疫反应的激活、持续的炎性反应、早期高动力和晚期低动力循环状态、多器官功能障碍及细胞因子反应的类似动力学变化。且通过控制结扎盲肠的长度及穿孔所用针头大小、穿孔数目等因素可调控脓毒症模型动物的死亡率，适于评估腹腔内感染［5，8-9］。但CLP模型可形成腹腔内脓肿和腹膜炎两种情况，模型的坏死组织也缺少像临床上手术切除的干预方式，所以有研究者提出可通过建立升结肠支架植入腹膜炎（colon ascendens stent petitonitis，CASP）模型解决这个问题。

CASP 模型是将一个固定管径的支架植入升结肠，使肠内容物持续渗漏到腹腔中，造成急性多菌性脓毒症性腹膜炎。脓毒症的严重程度可通过改变支架直径或在二次手术中移除支架并缝合肠穿孔来调节［10-11］。研究发现，当支架在3 h 内被移除时，小鼠预后较佳，而当支架植入超过9 h后被移除，小鼠死亡率增加。该模型血流动力学较稳定，炎性因子水平稳步、持续增长，常引起多器官功能障碍，适用于弥漫性腹膜炎新治疗方法的评价。但也有研究发现，随着细胞因子的快速升高，大鼠模型肝脏中促炎因子表达较多，抗炎因子表达较少，与肺中促炎因子表达较少而抗炎因子表达较多的情况相反，可能出现全身炎性反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）和代偿性抗炎反应综合征（compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS）在不同部位同时发生［12］。有学者提出盲肠结扎和切口（cecal ligation and incision，CLI）模型能更好地模拟脓毒症的急性发作，适用于脓毒症血流动力学改变和血气分析的短期研究［5］。但CLI 模型的应用还不广泛，其代谢、血流动力学和免疫反应的特征尚未充分阐明。

将实验动物盲肠内容物腹腔注射到其他动物体内的盲肠浆液注射模型（cecal slurry injection，CS）是诱导多微生物脓毒症的另一种方法。新生小鼠器官体积小，肠道发育不完全，盲肠结扎和穿刺难度高，故CS模型适用于研究新生儿脓毒症，且避免了手术模型造成组织损伤和缺血的影响［13］。

1.4 腹腔外脓毒症模型

有60%的临床前脓毒症模型采用的是腹腔感染模型，但在测试新的治疗方法时，腹腔外脓毒症模型也很重要。通过向气管或鼻腔内注入细菌，进而诱发肺部感染的动物模型，可用于研究脓毒症的局部病理情况。该模型的实验操作简单且可重复性高，能引起多器官损伤；但其细胞因子水平具有菌株特异性，病程受所选菌株和接种剂量、抗生素的影响，存在一定局限性［5，14］。

2 建立脓毒症模型的考虑因素

2.1 实验动物种类和品种品系

脓毒症动物模型在进一步了解脓毒症复杂病理生理机制方面具有重要作用，其中动物的选择是动物模型建立的首要问题，关系到模型能否成功复刻临床。虽然许多物种与人类有共同的发病途径，但在脓毒症方面，物种间的差异是显著的。

目前可用于建立模型的动物种类较多，学者们根据不同动物种类各自的特点，将其用于不同目的的研究。大型哺乳动物如猪、犬和灵长类，其遗传背景、生理特点与人类相似，可对血液和组织进行连续取样、连续监测器官功能状态，适于观察疾病发生发展过程，研究脓毒症的基本机制，但成本昂贵，常用于新治疗药物和治疗模式的最终试验。如灵长类动物黑猩猩，对于评价脓毒症免疫炎性反应具有重要价值。猪、犬多用于研究多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），也可进行离体细胞培养。小型哺乳动物如大鼠、小鼠、豚鼠等啮齿类动物，价格低廉，操作方便，易于进行转基因或基因敲除，用于观察脓毒症的病理生理变化，进行生存率及基因相关疾病机制研究［15-16］。

目前94%的脓毒症模型相关研究使用了啮齿类动物，其中小鼠模型占79%［17］。关于脓毒症建模的现有文献中，大多数实验选择了C57BL/6 小鼠。但小鼠总血容量过少，难以连续采集血液或组织样本以评估病理过程的时间依赖性，且有创性监测如血流动力学技术的使用受限，难以评估脓毒症的严重程度及所处阶段。

2.2 动物年龄

流行病学调查表明，年龄是脓毒症患者死亡率的独立预测因素，是决定脓毒症风险和预后的关键因素，而且在成年人群中脓毒症病死率随着年龄的增长呈线性增加。有研究者通过回顾性分析发现，年龄是小儿脓毒症严重程度的决定因素，年龄越小，病死率越高，3岁前婴幼儿死亡率高于3岁后的儿童和青少年［18-19］。小鼠生长周期可分为新生期（1 周龄）、幼龄期（3～8周）、成熟期（2～4 月龄）和中老年期（＞4 月龄），可根据实验目的与方法选择合适发育周期的小鼠进行实验。

目前新生小鼠脓毒症造模推荐选用CS模型，通过腹腔注射盲肠浆液（1.1～1.3 mg/g）模拟新生儿肠穿孔引起的多微生物脓毒症，其死亡率具有全身炎症和剂量依赖性的特点。对于幼龄期、成熟期及中老年期小鼠，大多采用注射外源性毒素模型及腹腔感染脓毒症模型，无论是CLP、CASP 还是CS、LPS，既依赖于剂量，也受多种因素如穿孔数目、植入支架直径等影响。目前大多数实验选用6～12周龄小鼠。在CLP及LPS模型中均发现老年小鼠死亡率更高（65%vs 20%），IL-6和TNF-α等炎性细胞因子水平更高，对抗炎性刺激的免疫反应能力更低，抗生素疗效愈差的特点［5，13，20］。

2.3 动物性别

性别差异影响脓毒症的发病率和预后。对2001—2012年包括6 134例成人脓毒症患者数据的回顾性分析表明，男性脓毒症患者90 d 和1 年死亡率及住院期间死亡率均较女性高，分别为45.1%比42.1%，55.6%比51.4%，33.8%比31.3%，女性临床结局优于男性患者的原因可能与激素的分泌、调节相关［21］，也可能与X染色体上一些基因参与调节免疫相关蛋白质编码、mRNA 转录有关，还可能是因为多态性X-连锁基因与细胞嵌合能使女性更好地对抗感染。同时睾酮可通过激活非基因组途径调节的丝裂原活化蛋白激酶信号等机制起到免疫抑制作用［22-24］。

研究发现，雌激素水平低下组小鼠巨噬细胞释放IL-1β 和IL-6 的量与正常组小鼠相比明显降低，提示雌激素有利于免疫功能的维持［25］。相对于雌激素变化明显的雌鼠来说，雄鼠可能更适合大多数脓毒症建模相关研究，而对于研究性激素作用及妊娠、卵巢切除术后对感染的易感性及其病理生理机制研究，则雌鼠更具价值。

2.4 辅助治疗

临床前脓毒症模型为了更接近临床，应尽量使用基本的辅助治疗，也可根据实验目的而定。脓毒症常会导致血压下降和组织灌注不足。2016 年的脓毒症和脓毒性休克管理国际指南建议，在确诊脓毒症或脓毒性休克后1 h 内应开始经验性静脉注射抗生素，3 h 内静脉注射至少30 mL/kg 的等渗晶体液。早期积极的液体复苏可显著增强脓毒症小鼠模型的临床相关性，并且将CLP小鼠术后4 d的存活率提高60%。而早期体液复苏不足可能无法复制临床脓毒症中出现的血流动力学异常状态。实验动物可通过静脉、皮下和腹腔内给药，为了密切模拟临床，液体复苏应通过静脉途径进行，但在静脉通路有限的小动物模型中，优先选择腹腔内给药，因此需结合模型的类型和研究目的选择合适的给药途径［26-27］。

抗生素的使用是早期治疗脓毒症及脓毒性休克的关键步骤，能提高CLP 术后实验动物存活率，但不是脓毒症模型中炎性反应和预后的主要决定因素。而且抗生素剂量需根据具体实验模型选择，目前尚无统一的给药方案。脓毒症和脓毒性休克管理国际指南建议，经验性使用广谱抗生素或基于模型和可能或已知的病原体选用抗生素。如对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌可用β-内酰胺类治疗，对大肠埃希菌用第二代或第三代头孢菌素或氨基糖苷治疗；对多种微生物感染，如肠穿孔（如CLP 和CASP 模型），可以使用广谱抗生素如碳青霉烯，或覆盖G+和G-需氧菌和厌氧菌的药物组合治疗。有学者曾对190 项小鼠脓毒症研究进行回顾性分析，结果显示β-内酰胺类使用最频繁（90%）。另外，感染部位也影响抗生素的选择，不能有效穿过血脑屏障的抗生素不适用于中枢神经系统感染。在大多数小型啮齿类动物脓毒症研究中，抗生素为皮下给药，大型哺乳动物的研究中推荐静脉注射给药［26，28］。

2.5 并发症

脓毒症患者临床上常伴有如肝肾疾病、糖尿病等慢性病。研究表明脓毒症患者平均伴有1.07个并发症。目前动物模型基本使用健康、年轻的动物，而理想的脓毒症动物模型应能模拟临床脓毒症的特点。但合并肾损伤的CLP模型血管通透性增加，细菌清除率下降，脓毒症程度比简单CLP 模型更重，且脓毒症存在凝血障碍会影响肝素治疗的效果。因此，可能复杂的脓毒症动物模型更适于评价药物疗效，研究有并发症的脓毒症动物模型更具临床意义［29］。

3 建立CLP模型的影响因素

大多数研究采用CLP 建立脓毒症模型，而在CLP手术操作过程中还有许多值得考虑的因素。

3.1 镇痛、镇静方式选择

在动物模型中，疼痛能影响动物行为和免疫系统功能。脓毒症模型推荐使用镇痛药物，镇痛药成为影响脓毒症模型存活率及炎性反应的重要因素。目前对于临床脓毒症患者使用镇痛药的类型及剂量尚无具体建议，且在临床前脓毒症研究中也较少提及。丁丙诺啡是啮齿类动物模型中最常用的镇痛药，在小鼠CLP模型中，通常是腹腔内或皮下注射，且尚无推荐剂量，大部分研究所使用剂量为0.05～0.1 mg/kg。研究发现，在脓毒症免疫相关机制的研究中应用丁丙诺啡对小鼠存活率、细胞因子水平的影响不大，相比于易导致细菌移位及促进细菌生长的吗啡，免疫抑制作用较弱的阿片类药物可能更适用于脓毒症炎症相关的研究［30］。

动物实验常需对动物进行麻醉。有研究表明，挥发性麻醉剂可增强巨噬细胞的吞噬作用，并降低TNFα、IL-1β mRNA 的表达，在一定程度上保护了体内缺血再灌注损伤的组织器官，缩短术后恢复时间，延长脓毒症小鼠的生存期［31-32］。而水合氯醛的麻醉效果仅为催眠镇静作用，依据动物伦理目前已不推荐腹腔注射水合氯醛用于动物麻醉［33］。Herrmann等［32］发现异氟烷麻醉在小鼠CLP 模型中对器官功能损伤、生存率的改变不明显，未显著影响预后。七氟醚、地氟醚麻醉可显著提高7 d生存率，减轻器官损伤，降低组织损伤标志物的表达。

目前在脓毒症模型中，镇痛镇静方式的选择、剂量选定、适用研究方面的文献不多，还待进一步研究摸索。

3.2 盲肠结扎长度及穿刺针的大小、数量

在CLP 模型中，盲肠结扎长度、穿刺针型号、穿孔数量都被认为与脓毒症模型损伤严重程度相关，且作为影响模型死亡率的重要因素。研究发现，在穿刺针大小和穿孔数量等影响因素一致的情况下，盲肠结扎穿孔长度是脓毒症严重程度的独立决定因素；结扎距离大于盲肠长度的5%时（约0.3 cm）才开始出现死亡，脓毒症严重程度及死亡率随结扎长度增加而提高［5，34］。但也有学者提出，盲肠结扎长度对脓毒症小鼠72 h 生存率无明显影响，生存率取决于盲肠体积而不是长度。因实验动物的盲肠形状不规则，盲肠长度在结扎穿刺过程中易发生变化，所以盲肠体积相对于长度来说能够更精确地控制感染灶大小［35］。

使用不同型号的针头，小鼠7 d 死亡率也不同，18 G 为100%，21 G 为50%，25 G 为5%，脓毒症的严重程度随穿刺针头直径增加而加重。随着穿刺针直径增大和穿孔数增多，粪便流入腹腔的速度越快，感染越重。因此，实验中通过把控盲肠结扎长度、穿刺针型号、穿孔数量等因素可能使CLP 模型的器官损伤、炎性反应、死亡率等得到控制［36］。

4 结语

综上所述，腹腔感染模型（如CLP）及注射外源性毒素模型（如注射LPS）是目前较为常用的脓毒症病理生理机制研究模型。建立稳定的动物模型的影响因素包括动物种类、品种品系、年龄、性别、辅助治疗等。通过动物模型能够系统研究脓毒症期间许多炎性介质、通路的作用以及阻止其产生、传递后的影响，但其临床前模型的预测价值有限，可能与动物和人类对感染反应程度不同、细胞的转录和表达相关性差、模型全身炎性反应不重及未出现MODS 等因素有关。脓毒症在中后期可出现长期免疫抑制状态，这时的死亡率较高，应为脓毒症治疗重点。目前，临床前实验研究尚缺乏针对脓毒症致MODS 的病理生理过程及临床特点的研究模型。有学者提出使用CLP 模型结合二次打击模型，即最初的创伤或感染发作后诱导继发感染，更接近临床上脓毒症晚期的实际免疫抑制状态，有助于阐明CLP 改变免疫功能的机制。也可尝试将严重疾病中出现的人类患者来源的病原体植入实验小鼠，模拟关键宿主的病原体相互作用［37-38］。但这些研究成果尚未转化为有效的新疗法，期待在后续的模型研究中能实现评估脓毒症治疗新策略的突破。

[作者贡献Author Contribution]

李潇提出文章思路，撰写、修订文章；颜海鹏对文章思路有重要建议，对文章框架及内容作批评性审阅；肖政辉对文章的知识性内容作批评性审阅，指导性支持。

[利益声明Declaration of Interest]

所有作者均声明本文不存在利益冲突。