巨噬细胞MED1缺失促进雌性ApoE和LDLR敲除小鼠动脉粥样硬化发展

温尔刚 ,高 杰 ,丁怡铭 ,鲍妙叶 ,张元鹍 ,张亚莉 ,赵四海,刘恩岐,白 亮

(1.西安交通大学医学部基础医学院实验动物学系,陕西西安 710061;2.西安交通大学医学部转化研究院心血管研究所,陕西西安 710061)

心血管疾病是严重危害人类健康和生命的“头号杀手”,具有高发病率、致残率和致死率等特点。流行病学资料显示,全世界每年约有1 730万人死于心血管疾病,预计到2030年将超过2 360万[1]。动脉粥样硬化是众多心血管疾病的共同病理基础,其发病是由多个遗传和环境因素相互作用所致,确切病因至今尚未明确。研究认为,动脉粥样硬化发生最为关键的触发因素是富含载脂蛋白的某些脂蛋白侵入动脉壁,诱导血液中单核细胞与血管内皮细胞黏附;单核细胞迁入内膜分化为巨噬细胞,并吞噬脂质形成泡沫细胞,进而融合堆积形成粥样斑块,引发一系列的血管炎症反应。作为动脉粥样硬化血管病变部位的主要免疫细胞,巨噬细胞表达与脂类摄取和胆固醇流出相关的基因受一系列核受体及转录辅激活因子的调控。比如,巨噬细胞的核受体辅抑制子1(NCOR1)通过抑制小鼠和人的PPARγ靶基因而抑制动脉粥样硬化的发展[2]。巨噬细胞中的核因子NFATc3通过上调miR-204而降低SR-A 和CD36水平,进而阻止泡沫细胞形成及动脉粥样硬化[3]。

MED1是一种非常重要的转录辅激活子,其通过两个LXXLL基序与许多核受体如PPARα、PPARγ、RARα、RXR、TRβ1、VDR、FXR、HNF4、ERα和GR等以配体依赖性方式结合。MED1通过调控相关基因的表达,参与脂质代谢、能量调控及癌症等病理生理学过程[4]。肝脏MED1特异性敲除(MED1△Liv)小鼠能够抵抗高脂饮食和PPARγ诱导的脂肪肝形成,且下游信号通路的aP2 和Cide A 等基因表达下调[5]。心肌MED1 敲除小鼠的心脏表现出心室扩张、射血分数降低和线粒体损伤,并导致代谢和线粒体相关基因表达失调[6]。在乳腺癌组织中MED1出现高表达,表明MED1在核受体ER 信号通路中也发挥着关键的调控作用[7]。

本课题组前期以巨噬细胞 MED1 敲除(MED1△Mac)的雄性小鼠为研究对象,发现MED1通过核受体PPARγ调控巨噬细胞极化,抑制动脉粥样硬化的发生和发展[8]。然而,巨噬细胞MED1 在雌性小鼠动脉粥样硬化发生过程中的作用尚不清楚。鉴于MED1在雌激素受体信号通路中发挥重要调控作用,本研究用巨噬细胞MED1与ApoE 双敲除雌性小鼠模型(MED1△Mac/ApoE-/-),以及接受MED1△Mac小鼠骨髓移植的LDLR-/-(MED1△Mac→LDLR-/-)雌性小鼠模型,研究巨噬细胞MED1缺失对雌性小鼠动脉粥样硬化形成的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

含有两个loxP 位点的MED1fl/fl和巨噬细胞MED1敲除(MED1△Mac)小鼠来自西安交通大学医学部实验动物中心。ApoE-/-小鼠和LDLR-/-小鼠购买自美国Jackson实验室。普通饮食和西方饮食饲料(含有21%脂肪,0.15%胆固醇)由西安交通大学医学部实验动物中心提供。所用实验动物均在西安交通大学医学部实验动物中心的无特定病原菌(specific pathogen free,SPF)屏障设施内饲养,小鼠自由饮水,12 h光照和12 h黑暗交替,环境温度为(22±2)℃。所有动物实验均经过西安交通大学医学部伦理委员会批准实施,实验过程遵循国家实验动物管理的相关法律和规定。

1.2 MED1△Mac/ApoE-/-小鼠模型的构建及基因型鉴定

将MED1fl/fl小鼠与Lyz2-Cre小鼠进行交配,获得MED1fl/+/Lyz2-Cre+/-杂合小鼠,此小鼠再与MED1fl/fl小鼠杂交,筛选获得MED1△Mac小鼠。此后,用MED1△Mac小鼠和ApoE-/-小鼠进行杂交,经基因型鉴定筛选获得双基因敲除MED1△Mac/ApoE-/-小鼠模型。用蛋白酶K 法提取小鼠尾部基因组DNA 进行PCR扩增后,用琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段。

1.3 骨髓移植实验

提取雌性MED1△Mac小鼠和其同窝对照MED1fl/fl小鼠股骨和胫骨中的骨髓。给8周龄雌性LDLR-/-小鼠照射9-Gy的铯γ射线,然后将5×106的MED1△Mac或MED1fl/fl小鼠骨髓细胞通过尾静脉注射入其体内。骨髓细胞移植后,用普通饮食饲养6周,再给予西方饮食饲喂12周。

1.4 血脂生化检测

MED1△Mac/ApoE-/-及MED1fl/fl/Apo E-/-对照小鼠、MED1△Mac→LDLR-/-及MED1fl/fl→LDLR-/-对照小鼠禁食4 h后,用含有肝素的毛细血管进行尾尖采血。使用中生北控生物科技股份有限公司的试剂盒检测血浆总胆固醇(total cholesterol,TC) 和总三酰甘油(total triglyceride,TG)水平。

1.5 动脉粥样硬化斑块面积的观察

MED1△Mac/ApoE-/-及MED1fl/fl/ApoE-/-对照小鼠、MED1△Mac→LDLR-/-及MED1fl/fl→LDLR-/-对照小鼠经西方饮食喂养12周,用异氟烷安乐处死小鼠,取出整个主动脉树以及心脏,将主动脉纵向切开,进行油红O 染色,拍照,使用WinROOF 6.5 软件评估斑块面积。用OCT 包埋主动脉根部,连续切片(8μm 厚),分别进行H&E 和油红O 染色,封片、拍照,使用Win ROOF 6.5软件评估斑块面积。

1.6 统计学分析

实验数据用平均值±标准误表示,采用Graph-Pad Prism 软件处理分析。两组间比较采用Studentt检验,P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功繁育MED1△Mac/ApoE-/-小鼠模型

将ApoE-/-小鼠与MED1△Mac小鼠进行交配,构建ApoE 和巨噬细胞MED1双敲除的MED1△Mac/ApoE-/-小鼠模型。PCR基因型鉴定结果显示,电泳条带只含有1.8 kb片段提示小鼠的两条同源染色体上均携带2 个loxP 位点,即MED1fl/fl小鼠;同时含有1.8 kb片段和700 bp片段,提示MED1fl/fl小鼠且Lyz2-Cre为阳性,即MED1△Mac小鼠;含有245 bp片段,表示ApoE基因被敲除,即ApoE-/-小鼠(图1)。

图1 MED1△Mac/ApoE-/-和MED1fl/fl/ApoE-/-小鼠基因型鉴定凝胶电泳图Fig.1 Genotyping of MED1△Mac/ApoE-/-and MED1 fl/fl/ApoE-/-mice

2.2 巨噬细胞MED1缺失促进ApoE-/-雌性小鼠动脉粥样硬化发生

2.2.1 MED1△Mac/ApoE-/-小鼠的血浆TC 和TG水平分析 实验组(MED1△Mac/ApoE-/-)和对照组(MED1fl/fl/ApoE-/-)小鼠饲喂12周西方饮食,体质量均无差异(图2A 和2B);两组小鼠血浆的TC 和TG 水平无明显差异(图2C 和2D),表明巨噬细胞MED1缺失不影响ApoE-/-小鼠血脂水平。

图2 巨噬细胞MED1缺失对ApoE-/-小鼠体质量及血脂影响Fig.2 Effects of macrophage MED1 deficiency on body weight and plasma lipids of ApoE-/-mice

2.2.2 MED1△Mac/ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的染色结果 实验组(MED1△Mac/ApoE-/-)和对照组(MED1fl/fl/ApoE-/-)小鼠饲喂西方饮食12周,主动脉树油红O染色结果表明:与对照组相比,实验组小鼠的主动脉斑块面积显著增加[(10.47±0.70)%vs.(17.29±3.13)%;对照组n=11,实验组n=10;P=0.038 3] (图3A);主动脉根部H&E和油红O染色显示:与对照组相比,MED1△Mac/ApoE-/-小鼠的主动脉根部斑块面积增加[(139.60±12.03)×103μm2vs.(207.02±29.46)×103μm2,对照组n=8,实验组n=7;P=0.044 4](图3B)。

图3 MED1△Mac/ApoE-/-小鼠主动脉树和主动脉根部油红O 染色及斑块分析Fig.3 Oil red O staining and statistical analysis of aortic tree and aortic root in MED1△Mac/ApoE-/-mice

2.3 巨噬细胞MED1缺失对LDLR-/-雌性小鼠动脉粥样硬化发生的影响

2.3.1 MED1△Mac→LDLR-/-小鼠的血浆TG 和TC水平变化 为进一步研究巨噬细胞MED1缺失对雌性小鼠动脉粥样硬化形成的影响,用LDLR-/-小鼠模型进行了骨髓移植实验。LDLR-/-小鼠基因型电泳鉴定结果显示只含有350 bp片段,提示小鼠的两条同源染色体上的LDLR 基因被敲除,即LDLR-/-小鼠;同时含有350 bp 片段和167 bp 片段提示为LDLR+/-小鼠;只含有167 bp片段提示LDLR+/+小鼠(图4A)。分别将MED1△Mac或MED1fl/fl小鼠骨髓移植到辐照后的LDLR-/-雌性小鼠,移植后6周,再用西方饮食饲喂12周以诱导动脉粥样硬化发生,结果显示,实验组(MED1△Mac→LDLR-/-)小鼠和对照组(MED1fl/fl→LDLR-/-)小鼠的体质量及血浆TG 和TC水平均无明显差异(图4B～4E),表明巨噬细胞MED1缺失不影响LDLR-/-小鼠血脂水平。

图4 巨噬细胞MED1缺失对LDLR-/-小鼠体质量及血脂影响Fig.4 Effects of macrophage MED1 deficiency on body weight and plasma lipids of LDLR-/-mice

2.3.2 MED1△Mac→LDLR-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积染色结果 西方饮食饲喂12周的主动脉树油红O 染色结果表明:与对照组(MED1fl/fl→LDLR-/-)小鼠相比,实验组(MED1△Mac→LDLR-/-)小鼠主动脉树斑块面积有增加趋势[(10.37±2.80)%vs.(18.32±3.95)%;n=5;P=0.139 5;图5A]。而且,主动脉根部H&E和油红O染色结果也显示:实验组小鼠的斑块面积有增加趋势[(175.80±4.90)×103μm2vs.(216.20±35.56)×103μm2,对照组n=5,实验组n=6;P=0.321 4;图5B]。

图5 MED1△Mac→LDLR-/-小鼠主动脉树和主动脉根部油红O 染色及斑块分析Fig.5 Oil red O staining and statistical analysis of aortic tree and aortic root in MED1△Mac→LDLR-/-mice

3 讨 论

动脉粥样硬化是引起众多心血管疾病的主要原因,会导致冠心病、心力衰竭、脑卒中等重大疾病[9]。动脉粥样硬化斑块破裂是冠状动脉血栓形成的主要原因。扩大的坏死核心、薄纤维帽、病灶部位新生血管生成、斑块钙化等因素均易导致斑块破裂[10]。斑块面积是衡量动物模型中动脉粥样硬化程度的重要指标。性别是心血管系统生理、病理和疾病发展的重要影响因素[11]。据统计男性冠心病的发病率为7.4%,而女性为6.2%[12]。多个研究表明,性别也同样会影响动脉粥样硬化的发病率和并发症的发生,男性的总体斑块水平和炎症指标高于女性[13]。本课题组前期研究已表明,巨噬细胞MED1缺失可导致雄性小鼠动脉粥样硬化斑块面积增加,但尚无有关雌性小鼠MED1缺失对动脉粥样斑块影响的报道。鉴于MED1在雌激素受体介导的基因表达调控中也发挥重要作用,而雌激素对心脑血管疾病具有一定的保护作用。因此,本研究使用ApoE-/-和LDLR-/-两种小鼠模型观察巨噬细胞MED1缺失对雌性小鼠动脉粥样发生发展的影响。通过动脉粥样硬化斑块面积分析,发现巨噬细胞MED1缺失导致雌性小鼠的斑块面积增加。

大量研究表明,动脉粥样硬化的发病机制与血脂异常和炎症密切有关[14]。TC和TG是衡量血脂水平的重要指标,血脂尤其是血浆胆固醇水平升高可促进动脉粥样硬化的发生发展。为探讨巨噬细胞MED1缺失促进雌性小鼠动脉粥样发生的具体机制,本研究分析了MED1△Mac/ApoE-/-和MED1fl/fl/ApoE-/-对照小鼠、MED1△Mac→LDLR-/-和MED1fl/fl→LDLR-/-对照小鼠的血脂水平。结果发现,巨噬细胞MED1缺失对ApoE-/-或LDLR-/-雌性小鼠的血浆TC和TG水平均无明显影响,说明巨噬细胞MED1缺失并未通过影响血脂水平而促进动脉粥样硬化的发展。

研究发现,巨噬细胞在动脉粥样硬化的发生和发展中起关键作用[15]。巨噬细胞与脂蛋白结合形成泡沫细胞,并引发炎症联级反应,增强白细胞的招募,进一步加剧动脉粥样硬化的发展[16]。巨噬细胞分为M1型和M2型。M1型巨噬细胞可分泌大量促炎因子,如TNF-α、IL-6 和MCP-1 等,促 进炎症 反应。M2型巨噬细胞可分泌一系列抗炎因子,如Arg-1、Chi3l3、PPARγ和IL-10 等,介导炎症消退,促进组织修复[17]。一般情况下M1型巨噬细胞产生的促炎因子会促进动脉粥样硬化的发展;M2型巨噬细胞有助于斑块消退[18]。研究报道,巨噬细胞MED1缺失会增加活性氧的积累,从而激活巨噬细胞促炎信号通路[19]。转录因子HOXA5 通过激活MED1 诱导巨噬细胞M2 型极化,从而抑制动脉粥样硬化的发展[20]。因此,以后可进一步研究MED1缺失对巨噬细胞表型转化、炎症通路以及炎症因子的调控,已明确MED1调控动脉粥样硬化发生发展的分子机制。