抵抗素诱导血管平滑肌细胞表型转化的作用及机制研究

李红芳，刘 鹏，曹 露，徐一君，陈志强，温 文

移植血管再狭窄是影响冠脉旁路移植术远期效果的重要原因，其主要病理基础是血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）发生表型转化、增殖、迁移［1］，导致血管重塑、狭窄。抵抗素等脂肪因子可诱导VSMC增殖、迁移，但具体机制尚不清楚。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophos⁃phate actived protein kinase，AMPK）／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号在VSMC增殖中发挥重要作用［2］。本实验观察抵抗素诱导VSMCs表型转化作用的可能机制，以及二甲双胍的防治作用，为防治移植血管再狭窄提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人血管平滑肌细胞（human aortic vascu⁃lar smooth muscle cells，HVSMCs）（ScienCell），高糖细胞培养基（DMEM）（Gibco），胎牛血清（杭州四季青），0.25%胰蛋白酶（北京全式金），盐酸二甲双胍（AMPK激活剂）（Sigma），重组人抵抗素（Pepro⁃Tech），细胞周期检测试剂盒（美国BD），UNIQ－10柱式Trizol总RNA提取试剂盒及引物（上海Sangon Biotech），cDNA合成试剂（PrimeScriptRT Master Mix Perfect Real Time）及荧光定量试剂盒（SYBR Premix Ex TaqTMⅡ）（大连Takara），p－AMPKα（Thr485）、mTOR、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）（Cell Signaling Technology），p－mTOR（Abcam），AMPKα1／2、β－肌动蛋白（β－actin）、HRP－linked antibody、Goat anti－rabbit IgG（武汉博士德）。

1.2 细胞培养与传代 HVSMCs复苏后，培养于含10%胎牛血清（FBS）、100 IU／ml青霉素及100 μg／ml链霉素的高糖DMEM中。于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养，2～3 d更换一次培养液，传至4～5代细胞进行实验。生长状态良好的细胞，1.0×105个／孔接种于六孔板，用高糖DMEM培养24 h，用不含FBS的高糖DMEM饥饿24 h，分组进行相应药物处理。

1.3 实验分组及处理 实验分4组：对照组（Con）：不加干预；抵抗素组（Res）：加入含50 μg／L抵抗素培养；二甲双胍组（Met）：加入含2 mmol／L二甲双胍培养；抵抗素＋二甲双胍组（Res＋Met）：二甲双胍2 mmol／L处理细胞2 h后，再加入抵抗素50 μg／L培养22 h。分组处理后的细胞继续孵育，各组孵育24 h后进行蛋白质免疫印迹（Western blot）检测p－AMPK、p－mTOR、AMPK、mTOR及Cyclin D1表达；孵育48 h后进行流式细胞术测定细胞周期，实时荧光定量聚合酶链反应（RT－PCR）测定α－平滑肌肌动蛋白（α－SMA）及骨桥蛋白（OPN）表达。抵抗素浓度的选择参考本研究前期研究结果及相关文献［3］。

1.4 流式细胞术检测细胞周期 胰蛋白酶消化并收集细胞，按照细胞周期检测试剂盒说明进行相应操作，流式细胞术检测。

1.5 实时荧光定量PCR（RT－PCR）检测相关基因表达 采用柱式Trizol法提取总RNA，并进行浓度测定，按照试剂盒步骤进行反转录及RT－PCR反应。引物：α－SMA：上游：5＇－GGCTGAAGAATG⁃GCGTGATT－3′，下游：5′－CTGCCATGTCTTTGCCT⁃TCA－3′；OPN：上游：5＇－ACTGATTTTCCCACGGAC⁃CT－3＇，下游：5＇－CTCCTCGCTTTCCATGTGTG－3＇；内参：β－actin。反应条件：95℃30 s，（95℃5 s，60℃31 s），40个循环，即得出相应CT值。待测样本目的RNA表达量相对值＝2－△△Ct，△△Ct＝△Ct待测样品－△Ct β－actin，△Ct＝Ct待测样品－Ct阴性对照。

1.6 Western blot法检测相关信号蛋白表达 收集细胞并裂解，提取总蛋白质，BCA法测得相应浓度。每泳道上样30 μg进行电泳；电泳结束后，Page－凝胶平衡后恒流半干转膜；BSA液封闭，室温2 h。抗体杂交，一抗1∶1 000稀释，4℃过夜；二抗1∶2 000稀释，室温孵育2 h。配制ECL化学发光液，荧光成像仪（ProteinSample－HD2）曝光成像。检测AMPK、p－AMPK、mTOR、p－mTOR和Cyclin D1表达量。

1.7 统计方法 应用SPSS 22.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析和t检验，所有数据采用平均数±标准差（±s）表示。以P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 抵抗素对HVSMCs细胞周期的影响 与Con组相比较，Res组细胞G0／G1期细胞减少（P＜0.01），S期细胞明显增多（P＜0.01）；二甲双胍预处理后，与Res组相比较，细胞G0／G1期细胞增多（P＜0.01），S期细胞明显减少（P＜0.01）。Con组与Met组相比G0／G1期细胞所占比例无统计学意义（P＞0.05）。Con组与Met组相比S期细胞所占比例无统计学意义（P＞0.05）。各组细胞及各期细胞所占比例见图1、图2、图3。

图1 经相应处理后的血管平滑肌细胞（100×）

图2 抵抗素对血管平滑肌细胞周期G0／G1期的影响

2.2 抵抗素诱导HVSMCs表型转化相关基因的表达 与Con组相比较，Res组α－SMA表达水平降低（P＜0.01），OPN表达水平升高（P＜0.01）；二甲双胍预处理后，较Res组α－SMA表达水平升高（P＜0.01），OPN表达水平降低（P＜0.01）。Con组与Met组相比α－SMA基因相对表达量无统计学意义（P＞0.05）。Con组与Met组相比OPN基因相对表达量无统计学意义（P＞0.05）。见图4、图5。

图5 抵抗素对血管平滑肌细胞骨桥蛋白基因的影响

2.3 抵抗素对HVSMCs表型转化相关蛋白表达的影响 细胞分组处理后通过荧光成像仪系统对各荧光条带扫描，计算各蛋白相对表达量。与Con组相比较，Res组p－AMPK表达量明显降低（P＜0.01），p－mTOR表达量明显升高（P＜0.01），Cyclin D1表达量明显升高（P＜0.01）；经二甲双胍预处理后，p－AMPK表达量升高（P＜0.01），p－mTOR表达降低（P＜0.05），Cyclin D1表达量降低（P＜0.05）；Con组与Met组AMPK、mTOR总量相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图6、图7。

图7 各组细胞p－AMPK、p－mTOR、Cyclin D1蛋白表达光度值相对值

3 讨 论

冠脉旁路移植术是治疗冠心病的主要方法之一，移植血管再狭窄是影响其远期效果的重要原因。在血管内皮损伤、局部炎症反应和多种细胞因子等局部因素，以及高血压病、糖尿病等全身因素的多重作用下，VSMC发生表型转化、增殖、迁移，导致移植血管重塑、狭窄［1，4］。血管平滑肌细胞由分化良好的收缩表型转化为去分化的合成表型，为以上病理过程的启动环节，阐明其具体分子机制，对防治移植血管再狭窄具有重要意义。

抵抗素是脂肪细胞和巨噬细胞分泌的富含同型半胱氨酸的肽类分子，具有引起胰岛素抵抗、诱发炎症反应、促使细胞增殖等多种生物学活性［5－6］。Hi⁃royuki等［7］研究发现，抵抗素可以诱导血管平滑肌细胞增殖，促进动脉粥样硬化形成。近期研究发现，抵抗素也可以促进高糖诱导的VSMC表型转化及增殖［8］。本实验通过抵抗素干预HVSMCs，通过RTPCR法检测显示，平滑肌细胞收缩型标志蛋白基因α－SMA明显减少，分泌型标志蛋白基因OPN表达明显增多，提示抵抗素可以诱导HVSMCs表型转化。

AMPK是调节细胞能量代谢关键激酶，通过感知细胞能量代谢状态，调节ATP合成与分解代谢，进而调节细胞生物活动［9］；mTOR可感知细胞营养、能量代谢等外界刺激，整合细胞内信号传导，并传至细胞核内诱发相应生物效应［10］。实验研究证实，AMPK／mTOR信号通路在VSMC增殖、迁移及周期变化中发挥重要作用［11］。Yang等［12］通过大鼠动静脉瘘模型中发现，通过激活AMPK，抑制mTOR而抑制大鼠VSMC表型转化。本实验中发现，抵抗素可以诱导HVSMCs表型转化，与AMPK磷酸化表达减少，mTOR磷酸化表达增加有关。通过二甲双胍激活AMPK可以逆转抵抗素诱导的表型转化作用。据此，我们推测抵抗素可以通过抑制AMPK／mTOR信号通路诱导HVSMCs表型转化，在移植血管重塑中发挥起始作用。

Cyclin和细胞周期蛋白激酶（CDKs）组成的复合体Cyclin／CDKs是调控细胞周期的主要信号蛋白分子，其中CDKs保持相对恒定，主要通过Cyclin的周期变化来完成细胞周期调控［13］。Cyclin D1结合并激活CDK4而促进细胞周期由G1期进入S期，从而引起细胞增殖，在细胞周期调控中起关键作用［14－15］。研究发现，脂联素激动剂AdipoRon可以激活mTOR信号而上调Cyclin D1表达，抑制血小板生长因子诱导的VSMC增殖［16］。本研究显示，抵抗素可诱导HVSMCs的G0／G1期细胞减少，S期细胞明显增多，通过二甲双胍预处理HVSMCs后，G0／G1期细胞增多，S期细胞减少。进一步研究发现，Cyc⁃lin D1表达明显增加，而通过二甲双胍预处理细胞，Cyclin D1表达明显减少。这提示抵抗素通过抑制AMPK／mTOR信号，上调Cyclin D1表达，促进细胞进入S期，进而使VSMC由收缩型向合成型转化。

实验研究表明，二甲双胍具有抑制肿瘤细胞增殖，改善心肌细胞肥大，减缓血管内膜重塑等多种生物作用［17］。本研究发现，经二甲双胍预处理的HVSMCs明显改变细胞表型转化，可能与抑制AMPK／mTOR信号有关，但能否在移植血管狭窄防治中起到同样作用，需要进一步研究证实。

综上，抵抗素可以诱导HVSMCs表型转化，其机制可能是抑制AMPK，激活mTOR信号，进而上调细胞周期蛋白Cyclin D1表达，促进细胞进入S期，诱导表型转化。二甲双胍可减轻抵抗素对血管平滑肌细胞表型转换的作用，有潜在抑制冠脉移植血管平滑肌细胞增殖、重塑及防治移植血管狭窄的作用。