正交试验法优选水药八角莲的姜制工艺*

孙晓惠，陆锦锐，李雪营，王传明，赵 成，王海琼

(黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000)

水药八角莲为小檗科鬼臼属植物八角莲[D.versipellis(Hance)M.Cheng ex Ying]、小八角莲[D.difformis(Hemsl.et Wils.)T.H.Wang ex Ying]、六角莲[D.pleantha(Hance)Woodson]、川八角莲[D.veitchii(Hemsl.ex Wils)Fu ex Ying]、云南八角莲[D.aurantiocaulis(Hand.-Mazz.)Hu]的干燥根及根茎，为我国特有的药用植物[1]。八角莲以鬼臼之名始载于《神农本草经》，性凉，味甘，微苦，有小毒。具有清热解毒、化痰散结、祛瘀消肿的功效，可用于治疗痈肿、疔疮、瘰疬、喉蛾、跌打损伤、蛇虫咬伤等[2]。现代药理研究表明，八角莲具有抗肿瘤[3]、抗菌[4]、抗病毒[5]和抗蛇毒等作用。但是八角莲具有细胞毒性，民间常有因摄入过量致中毒或死亡的报道[6]。有毒副作用的药物，经过炮制可明显降低，甚至消除其毒性或副作用，从而确保用药安全[7]。本实验采用正交试验法，依据《中国民族药炮制集成》[8]对八角莲的姜制工艺进行优化。

1 实验部分

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；BT-600电子天平(启东有铭衡器有限公司)；电炉(广西灌阳县元利电器厂)；KQ-3200超声波清洗器(昆山美美超声仪器有限公司)；2500C多功能粉碎机(永康市艾泽拉电器有限公司)；JA2003N电子天平(上海菁海仪器有限公司)。

1.2 试剂

鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山奈酚的标准品(北京百灵威科技有限公司，编号分别为131142、203057、268623、258643)；甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；生姜(都匀市斗篷山路沃尔玛超市)。

1.3 试药

对贵州都匀、罗甸等县市的八角莲属药材资源进行了野外考察和样品收集，收集的样品由黔南民族医学高等专科学校生药教研室王传明副教授鉴定，分别为八角莲[Dysosma versipellis(Hance) M.Cheng ex Ying]、贵州八角莲[D. majorensis (Gagnep.)Ying]、川八角莲[D. veitchii (Hemsl. et Wils.)Fu ex Ying.]和小八角莲[D. difformis (Hemsl.et.Wils.)T.H. Wang ex Ying]。

2 方法与结果

2.1 HPLC测定鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山奈酚的含量

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；进样量：20 μL；检测波长：290 nm。流动相为A乙腈，B 0.1%磷酸。梯度洗脱条件：0～15 min,25%～30% A;15～25 min 30%～50% A[9]。色谱图如图1所示。

A. 醋制品;B.生品;C.混合标准品;1.4′-去甲基鬼臼毒素；2.槲皮素；3.山奈酚；4.鬼臼毒素。图1 八角莲HPLC色谱图

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取鬼臼毒素对照品 15.300 mg、4′-去甲基鬼臼毒素对照品 0.212 mg、槲皮素对照品 1.490 mg、山奈酚对照品 2.040 mg，置于 10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，振荡均匀即可制成相应浓度的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

精密称取过三号筛(355 μm±13 μm，50目)的药材粉末 1.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入80%甲醇，料液质量比为1∶10。精密称定质量，超声 40 min,放置室温，80%甲醇补足减失的质量，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得供试品溶液[9]。

2.2 姜制八角莲炮制工艺优选

2.2.1 生八角莲饮片制备

取八角莲原药材，除去残茎及杂质，洗净，润透，切厚片，干燥，即得。

2.2.2 生姜汁的制备

称取已切丁的生姜末 20 g，加水 100 mL(5倍量)于烧杯中，置于电热套内煎煮 20 min,纱布过滤生姜汁；再加水 100 mL 继续煎煮 20 min,合并生姜汁。将总生姜汁浓缩至 40 mL(0.5 g/mL)。

2.2.3 因素水平

根据八角莲根茎的性质及查阅文献，选取姜用量、闷润时间、炒制时间为考察因素。经单因素考察确定因素水平，以鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山奈酚总含量为考察指标，采用L9(34)正交试验法优选姜制八角莲的炮制工艺，因素水平详见表1。

表1 因素水平表

2.2.4 药物的炮制

取八角莲9份，每份 50 g，根据表1、表2安排，加入一定量姜汁置烧杯中，拌匀，闷润。将闷润后的药物，置于预热的炒锅内，炒制定量时间后取出，晾凉，除去药屑。试验安排及结果见表2，方差分析见表3。每组平行制备3份。

表2 正交试验安排及直观分析

表3 姜制工艺方差分析

空白列D项为误差项，表中R为极值，R值越大，则某个因素越重要。从表3方差分析结果可知，C(炒制时间)对试验结果有较显著影响，A(姜用量)、B(闷润时间)影响不显著。可以看出，最佳炮制工艺以第3组实验即A1B3C3为佳，即姜用量5%，闷润时间 60 min,炒制时间 12 min。

2.2.5 验证试验

为验证该工艺的稳定性，按优选出的最佳工艺A1B3C3进行验证性实验，平行制备3份。测得4种指标成分总质量分数平均值为 10.6048 mg/g。结果表明，优选的八角莲姜制工艺合理可行，制备的姜八角莲饮片质量稳定。

3 小结

本研究首次对八角莲进行了姜制的工艺研究，以八角莲中指标性成分为指标，对姜用量、闷润时间、炒制时间进行了考察，经直观分析和方差分析得出影响八角莲姜制的因素为：炒制时间>姜用量>闷润时间。优选的姜制工艺为A1B3C3，即姜用量5%，闷润时间 60 min,炒制时间 12 min。验证性实验表明，此工艺合理、可行，制备出的姜八角莲饮片质量稳定可控，为八角莲后期进行炮制减毒增效研究奠定了基础。