导致CD36缺失的基因新突变CD36c.T200A(p.Ile67Asn)

蒋丽红，吴国光，陈洁润，李丽兰

南宁输血医学研究所南宁中心血站，广西 南宁 530003

CD36 蛋白也称糖蛋白Ⅳ (GPⅣ)、GPⅢb、GP88、PASⅣ等，相对分子量约88 000[1]，是一种多肽单链的跨膜糖蛋白(B 型清道夫受体，SR-B2)，可与多种配基相结合。它在人体内的分布广泛，在血小板、单核细胞、有核红细胞、星型胶质细胞、树突状细胞、视网膜上皮细胞、心肌和骨骼肌等细胞表面均有表达[1]。它还有脂质配体和蛋白质配体两大类配体，包括低密度脂蛋白、脂类、脂肪酸、胶原、血小板反应蛋白也是CD36的配体之一。

在生物多样性进化过程中，部分健康个体中出现CD36 缺失[2-3]。CD36 缺失包括两类表现型：Ⅰ型缺失，血小板上不表达CD36，单核细胞上亦不表达CD36；Ⅱ型缺失，血小板上不表达CD36，但单核细胞上表达CD36[4]。CD36 缺失个体可通过移植、妊娠或输血等途径接触CD36抗原，引发CD36同种抗体的产生，从而导致免疫性血小板输注无效、胎儿和新生儿同种免疫血小板减少、输血后紫癜等同种免疫血小板免疫异常疾病[5-6]。CD36 缺失个体在不同种族、人群中的分布不同，在高加索人中比较少见(0～0.06%)，在中国人群中CD36 缺失个体比例较高为1.8%～4.13%，其中广西人群中的CD36缺失个体比例高于其他中国地区人群(4.13%)[3，7-11]。本研究在一名广西CD36缺失个体中发现了可导致CD36缺失的CD36基因新突变，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 先证者为女性，1964 年11 月出生，壮族，为本实验室在广西人群CD36缺失分布特征研究中发现并确认的CD36 缺失个体[1]；其女1986 年11月生，壮族；使用EDTA抗凝管采集所有受试者静脉血5 mL，于-20℃保存待检。本研究已通过本单位伦理审查批准，并按伦理审批意见征得研究对象知情同意，并签署知情同意书后采集样本。

1.2 仪器与试剂 鼠抗人CD36 单抗(美国东南威斯康星血液中心Dr.BrianR.Curtis 馈赠)，邻苯二胺(丹麦Dako 公司，批号：20002056)，Pure gene DNA Purification Kit(QIAGEN，德国，批号：8850000298)，扩增引物(上海捷瑞生物工程有限公司合成)，TRIZOL(Invitrogen，美国，批号：15596026)，One Step RNA PCR Kit (TaKaRa，日本，批号：AJ30794A)，DNA 胶回收试剂盒(Axygen，美国，批号：15318KE1)，pLV4/StripII-HIS10(深圳盎然生物)，无内毒素质粒小提中量试剂盒(TIANGEN，北京，批号：S8008)，Mem-PERTM Plus试剂盒(Thermo，美国，批号：89842Y)，PCR扩增仪(ABI，美国，GeneAmp9700 型)，凝胶成像分析系统(Bio-Rad，美国，Molecular Imager Gel DocTM XR System)，流式细胞仪(BD 公司)，转膜仪(美国 Bio-Rad，Trans-Blot Turbo Transfer System)等。

1.3 方法

1.3.1 CD36 表型检测 运用本实验室建立[12-13]的血小板流式细胞荧光免疫检测试验(platelet immunou fluorescence test-flow cytometry，PIFT-FC)、血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定试验(monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigen，MAIPA)检测CD36 于血小板上的表达情况。运用本实验室建立的单核细胞检测流式细胞荧光免疫检测技术(monocyte immunoufluorescence test-flow cytometry，MIFT-FC)[11-12]检测CD36于单核细胞上的表达情况。

1.3.2 全血DNA和全血总RNA抽提 研究对象血样 DNA 使用 Pure gene DNA Purification Kit 试剂盒按照试剂盒说明书提取，于-20℃冻存备用。应用传统的手工TRIzol 法对研究对象的全血总RNA进行抽提，冻存于-80℃备用。

1.3.3 CD36 基因检测 按照本实验室建立的方法[13-14]，对先证者及其女儿的CD36 基因(参考序列：NG_008192.1，下同)外显子3～14进行测序，反转录扩增获取包含CD36 mRNA(参考序列：NM_000072.3，下同)开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)序列全段的cDNA(简称 CD36 cDNA)，构建包含 CD36 cDNA 和荧光报告基因EGFP的pLV4/StripII-HIS10真核表达质粒(简称CD36-EGFP质粒)后，筛选培养，挑取克隆菌落，经菌落PCR验证为阳性菌落后，扩大培养阳性菌落，应用质粒抽提试剂盒抽提质粒，并对质粒进行克隆测序。

1.3.4 真核稳定表达细胞株的建立 按本实验室建立方法[14-15]，将CD36-EGFP真核质粒转染入CHO-K1细胞系，筛选和建立包含CD36 cDNA转录本变异体的真核表达细胞株(MT-CD36 细胞株)，并建立作为下一步蛋白印迹实验的阳性对照的含有CD36 cDNA野生型转录本的真核表达细胞株(WT-CD36 细胞株)，和作为蛋白印迹实验的阴性对照的仅含EGFP基因的真核表达细胞株(EGFP-细胞株)。对建立并且筛选成功的细胞株进行细胞株总RNA抽提，通过反转录扩增测序验证所建立细胞株对所转染的目的基因的表达情况。

1.3.5 Western Blot 蛋白印迹验证实验 根据参考文献[14]的方法，应用Mem-PERTM Plus 试剂盒提取上述构建成功细胞株的细胞膜蛋白，并使用Western blot实验检测上述建立细胞株的CD36蛋白表达情况。

2 结果

2.1 CD36 表型检测结果 经MAIPA、PIFT-FC和MIFT-FC 检测，先证者的CD36 在血小板和单核细胞上均不表达，为Ⅰ型CD36 缺失；CD36 在其女儿的血小板和单核细胞上均呈阳性表达，为CD36 表达阳性个体，见图1。

图1 CD36表型分析结果

2.2 CD36 外显子测序结果 先证者于CD36 外显子4 中有CD36c.T200A 突变杂合子，其他外显子3及5～14 均未发现基因突变；其女儿CD36的外显子3～14中未发现基因突变，见图2。

图2 CD36外显子测序结果

2.3 CD36 cDNA克隆测序结果 先证者包含两种CD36 mRNA 转录本：CD36 c.T200A(p.Ile67Asn)(Gen-Bank的注册号：HM217022.1)转录本变异体和CD36的野生型转录本；其女儿只有野生型CD36mRNA 转录本，见图3。

图3 先证者CD36 cDNA克隆测序结果

2.4 真核表达细胞株的建立结果 成功建立了表达CD36c.200T＞A转录本变异体的真核表达细胞株(MT-CD36细胞株)、表达CD36野生型转录本的真核表达细胞株(WT-CD36 细胞株)和仅表达EGFP 荧光报告基因的真核表达细胞株(EGFP-细胞株)，并通过mRNA的逆转录扩增测序验证，比对细胞株mRNA逆转录产物cDNA和转入质粒的目的基因片段，结果显示所建立的细胞株所表达的CD36cDNA序列或/和EGFP基因序列与转染的基因片段均一致，比对结果见图4和图5。

图4 所建立的真核表达细胞株CD36 cDNA 与转入质粒CD36 cDNA目的片段电泳结果

图5 所建立的真核表达细胞株CD36 cDNA 与转入质粒CD36 cDNA目的片段测序结果比对

2.5 Western blot 蛋白印迹验证结果 所建立的MT-CD36细胞株和阴性对照EGFP-细胞株的CD36蛋白表达为阴性，而阳性对照WT-CD36 细胞株CD36 蛋白表达为阳性，见图6。

图6 Western blot蛋白印迹实验结果

3 讨论

人CD36 基因全长32 Kb，位于常染色体7q11.2上，含有15个外显子。其中外显子3～14编码CD36蛋白，所编码的CD36蛋白由472个氨基酸组成[14]。目前已报道的有超过40 个基因突变可导致CD36 缺失，基因突变有多种形式，包括单核苷酸取代、碱基插入、碱基缺失及mRNA 剪切加工中的外显子跳读等[14，16-17]。本研究在广西CD36缺失的个体中发现了一个可导致CD36 缺失的 CD36 基因新突变 c.T200A(p.Ile67Asn)，并探讨其导致CD36缺失的分子生物学基础。

该CD36基因新突变被发现于一名广西壮族女性个体，其CD36 表型经检测鉴定为Ⅰ型CD36 缺失，即血小板和单核细胞上的CD36表达均缺失。为探索该个体CD36 缺失的分子生物学基础，本研究分别从DNA和mRNA水平进行研究分析，在DNA水平，针对涉及编码CD36蛋白的CD36外显子3～14进行测序检测，发现先证者具有CD36 c.200T＞A 突变杂合子，该突变位于CD36 外显子4 上。在mRNA 水平，通过CD36 cDNA克隆测序检测，探讨该个体CD36转录遗传信息的变化情况，发现先证者携带有CD36 c.200T＞A转录本变异体(GenBank的注册号：HM217022.1)和CD36野生型转录本等两种mRNA 转录本，其中CD36c.200T＞A 转录本变异体可导致所编码CD36 蛋白的第67位氨基酸由异亮氨基酸(Ile)变为天冬酰胺(Asn)。

本研究通过建立真核表达细胞株和Western blot实验探讨CD36 转录本变异体c.200T＞A(p.IIe67Asn)对CD36 蛋白表达的影响，确证了携带CD36 c.200T＞A转录本变异体的真核细胞株(MT-CD36细胞株)不表达CD36，而携带野生型CD36 转录本的真核表达细胞株的CD36表达为阳性，证实该CD36 mRNA转录本变异体可导致CD36 表达缺失，是CD36 新突变c.T200A(p.Ile67Asn)导致CD36缺失的分子生物学基础。在文献报道中[1，13-14，20]，单位点的 CD36 杂合突变杂在 CD36Ⅰ型缺失个体、Ⅱ型缺失个体，以及CD36表达阳性个体中均有发现，这可能是由于不同个体间存在不同转录调控机制所致[1，14，18-19]。本研究的Ⅰ型CD36缺失个体，具有单个位点的CD36 DNA突变杂合子(CD36 c.200T＞A)，其CD36 mRNA转录本包含了该位点的突变型转录本变异体和CD36 野生型转录本，最终CD36表达却表现为Ⅰ型CD36缺失，这可能由于该个体中CD36 c.200T＞A突变型转录本的转录表达占据优势而最终导致该个体表现为CD36表达缺失，这仍需进一步研究和探讨。

在先证者的家系调查中，其女儿未遗传来自先证者的CD36突变基因，CD36表达为阳性。很遗憾由于先证者父母已过世，而其丈夫和兄弟姐妹等其他家系成员经反复动员均不同意提供样本参加本研究，因此未能展开深入的家系调查。

由于人群多态性原因，不同人群中导致CD36 缺失的CD36基因突变特征有所不同，在非洲CD36缺失个体中，以c.975T＞C 突变的频率最高，而在日本则以c.268C＞T 和 c.329_330del 突变最为常见[7]。在我国，LIU等[3]对来自我国吉林、山西、云南、贵州、青海、广东等地献血者开展的CD36 缺失的相关研究中，检测到的 82 例 CD36 缺 失 个 体 中 ，以 329-330delAC 和1228-1239delATTGTGCCTATT最为常见；在广西目前已报道的抗-CD36介导的血小板同种免疫案例，具有的 CD36 基因突变包括 c.380C＞T、c.329-330delAC、c.1156C＞T等[17]，研究并在广西CD36缺失个体中发现了多个可导致CD36 缺失的新突变如c.538 T＞C、c.430-1G＞C、c.1006+2T＞G等[13-14，20]。本研究是在广西CD36 缺失个体人群中发现的又一个可导致CD36 缺失的基因新突变，CD36 基因突变的多样性及陆续发现的新突变体现了广西地区导致CD36 缺失的CD36基因突变具有其独特的人群特征。

综上，本研究在广西地区的1名壮族Ⅰ型CD36缺失个体中，发现了1 个CD36 基因新突变c.T200A(p.Ile67Asn)(GenBank:HM217021.1)，其可导致 CD36 缺失，本研究的结果为中国人群导致CD36 缺失的分子基础研究提供了实验和理论依据。