平肺口服液对急性放射性肺损伤大鼠肺损伤及p38MAPK/Nrf2/HO-1信号通路的影响

黄 婷，邓 博，程志强

(1. 宁夏回族自治区人民医院，宁夏 银川 750002；2. 中日友好医院，北京 100029)

放射性肺损伤(radiation induced lung injury,RILI)是胸部恶性肿瘤行放疗后最常见的并发症之一，进展至后期可危及生命。RILI发生机制目前尚不十分明确，其中氧化应激反应与RILI的发生、发展密切相关[1]。研究表明，血红素氧合酶1(HO-1)是机体内最经典的防御酶之一，受p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)/核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路调控表达，可有效拮抗氧化应激以维持细胞自身功能稳定，在各种急慢性损伤中发挥着重要作用[2]。本课题组前期研究证明，中药复方平肺口服液可通过调节肺组织炎性细胞因子的表达及诱导肺成纤维细胞凋亡等来减轻RILI，在治疗RILI方面有较好的应用前景[3-8]。在以往研究的基础上，本实验进一步从氧化应激的角度探讨了平肺口服液治疗急性RILI的可能机制。

1 实验材料与方法

1.1动物 6周龄的SPF级SD健康雄性大鼠18只，体重(200±20)g，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号：SCXK20190010。饲养于中日友好医院临床医学研究所SPF级动物室，3只/笼，饲养环境湿度40%～50%，温度24 ℃，摄食饮水不限，每周换水并添加饲料。

1.2药物及制备 平肺口服液为中日友好医院院内制剂，方药组成：麦冬15 g、瓜蒌10 g、百合15 g、白及10 g、浙贝母10 g、鱼腥草30 g、桑白皮30 g、五味子15 g、白花蛇舌草30 g，生药含量2 g/mL，10 mL/支，生产批次：20201019。

1.3主要仪器与试剂 23EX直线加速器(美国Varian医疗系统公司)；EB-280M微量电子天平(日本Shimadzu公司)；BX46F正置光学显微镜(日本Olympus公司)。Anti-Heme Oxygenase 1抗体[EPR18161-128](ab189491)，Anti-Nrf2抗体(ab89443)，Anti-p38 alpha/MAPK14抗体[E229](ab170099)[艾博抗(上海)贸易有限公司]。

1.4实验方法 大鼠适应性喂养3 d后，随机分为正常组、模型组及平肺口服液组，每组6只，饲料、饮水不限。模型组和平肺口服液组大鼠进行急性放射性肺损伤造模：大鼠麻醉后固定于自制的大鼠固定架上，使其平躺于照射台，上、下分别垫2 cm及10 cm厚等效物，以大鼠前肢两腋窝中点连线为上限、剑突水平为下限，调整照射野范围约4.5 cm×4 cm。每次将6只大鼠并排同时放置在照射台上，用直线加速器行6 mV X射线全胸单次照射，总剂量20 Gy。照射完毕后送回动物室继续按组别常规干预饲养。自造模当日起，平肺口服液组大鼠灌胃平肺口服液20 g/(kg·d)，正常组和模型组大鼠灌胃生理盐水，灌胃量均为2 mL/d，1次/d，连续28 d。

1.5检测指标与方法 ①观察各组大鼠精神、皮毛等一般状况，记录各组大鼠造模前及灌胃14 d、28 d的体重。②末次灌胃结束后次日处死大鼠，摘取各组大鼠全肺，观察肺组织大体形态，计算肺指数。③取右下肺组织制备蜡块，切片后行HE染色，光镜下观察肺组织病理形态。先后在100倍、400倍镜下查看选取大鼠肺泡炎较重的区域，参照Szapiel的分级标准对其进行评分及半定量分析。④免疫组化法测定各组大鼠肺组织中HO-1、Nrf2、p38MAPK蛋白表达情况，PBS代替一抗为阴性对照，应用IPP软件分析每个视野的平均光密度(IOD)值。

2 结 果

2.1各组大鼠一般状况及体重比较 受照射的2组大鼠逐渐出现精神状态异常，易受惊吓，拱背竖毛，呼吸加快，躁扰不安。模型组大鼠明显精神萎靡，行常规灌胃等操作时表现尤为躁动、易伤人；平肺口服液组大鼠反应尚可。模型组大鼠照射后14 d出现胸背部及受照区域皮毛枯槁脱落，眼周鼻周红赤；照射后28 d脱毛明显，可见脱毛带，同时尾巴呈黄色且无光泽。平肺口服液组大鼠脱毛程度较轻，皮毛细密及光泽程度尚可。模型组大鼠体重增长缓慢，照射后14d、28d均明显低于同期正常组(P均<0.05)；平肺口服液组照射后28 d体重明显高于模型组(P<0.05)，与正常组相近(P>0.05)。见表1。

2.2各组大鼠肺组织大体形态及肺指数比较 正常组大鼠双肺表面润泽，呈嫩红色，质地柔软，边缘锐利；模型组大鼠双肺显著增大，呈无光泽的暗红色及红褐色，弹性差，部分肺叶缩小且质地变硬呈实变状态，个别大鼠取材中可见非血性积液；平肺口服液组大鼠肺组织在色泽、质地、弹性、充血水肿方面较模型组均有改善，未见明显胸腔积液，部分肺叶呈现正常状态。正常组、模型组、平肺口服液组肺指数分别为(3.95±0.14)mg/g、(7.90±0.49)mg/g、(4.79±0.22)mg/g，模型组明显高于正常组(P<0.05)，平肺口服液组明显低于模型组(P<0.05)。

表1 正常组和急性放射性肺损伤各组大鼠不同时间体重比较

2.3各组大鼠肺组织病理形态比较 HE染色显示，正常组大鼠肺泡组织结构清晰，肺泡间隔正常，腔内少有炎性渗出；模型组大鼠肺组织发生广泛炎性改变，大量炎细胞浸润致使肺泡腔减小，间隔显著增厚，肺泡结构塌陷融合，部分肺组织呈代偿性肺气肿；平肺口服液组整体炎性改变程度较模型组轻。见图1。

图1 正常组和急性放射性肺损伤各组大鼠肺组织HE染色表现

2.4各组大鼠肺泡炎评分情况比较 正常组大鼠肺泡炎评分为(0.84±0.75)分，其中0分占50.0%(3/6)，1分占33.3%(2/6)，2分占16.7%(1/6)，考虑可能因取材过程中急性肺充血水肿所致。模型组肺泡炎评分为(2.67±0.52)分，明显高于正常组(P<0.05)，其中2分占33.3%(2/6)，3分占66.7%(4/6)。平肺组大鼠肺泡炎评分为(1.83±0.41)分，明显低于模型组(P<0.05)，其中1分占16.7%(1/6)，2分占83.3%(5/6)。

2.5各组大鼠肺组织中HO-1、Nrf2、p38MAPK蛋白表达情况比较 模型组大鼠肺组织中HO-1、p38MAPK蛋白表达IOD值均明显高于正常组(P均<0.05)，Nrf2蛋白表达IOD值与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)；平肺口服液组大鼠肺组织中HO-1、Nrf2蛋白表达IOD值均明显高于模型组(P均<0.05)，p38MAPK蛋白表达IOD值明显低于模型组(P<0.05)。见表2及图2～4。

表2 正常组和急性放射性肺损伤各组大鼠肺组织中HO-1、Nrf2、p38MAPK免疫组化IOD值比较

图2 正常组和急性放射性肺损伤各组大鼠肺组织中HO-1表达情况(免疫组化染色)

图3 正常组和急性放射性肺损伤各组大鼠肺组织中Nrf2表达情况(免疫组化染色)

3 讨 论

RILI是一个受到放射生物、放射物理及患者本身状态等多因素相互作用和影响，同时由多种细胞参与、多种因子共同调控、多种机制综合作用的病理进程，而启动这个复杂过程的直接原因是放疗时大量射线作用于机体引发了机体的氧化应激反应。机体在遭受氧化应激损伤的过程中，形成了一套十分完整的防御保护机制，其中p38MAPK/Nrf2/HO-1通路是目前已知的内源性抗氧化信号通路中十分重要的一条[9]。

HO-1是最经典的内源性防御酶之一，其表达上调，可使组织细胞对缺血缺氧及多种毒物损害的耐受力增强。Kunwar等[10]报道，若在小鼠照射前后人为上调抗氧化酶表达，则小鼠肺损伤显著减轻，生存期更长，说明HO-1含量的多少与RILI是否发生及发生程度直接相关。Nrf2在对抗氧化应激时起到中枢因子的作用，在抑制炎症因子合成、分泌的同时，还能调控抗氧化酶以代谢清除细胞中活性氧类物质及各种自由基，由此触发下游相关基因的链式转录表达而发挥保护作用[11]，Nrf2含量的多少可间接反映机体抗炎、抗氧化损伤的能力。本实验结果显示，平肺口服液组大鼠肺组织中HO-1、Nrf2蛋白表达上调，提示平肺口服液可以通过激活Nrf2通路来诱导HO-1表达从而发挥保护RILI作用。

图4 正常组和急性放射性肺损伤各组大鼠肺组织中p38MAPK表达情况(免疫组化染色)

p38MAPK是多种转录因子的上游信号调节器，可被低氧及高氧状态、紫外线照射、多种细胞因子等各种刺激信号激活[12]。一方面，p38MAPK的磷酸化是激活Nrf2促使HO-1表达的重要途径；另一方面，过度表达的p38MAPK又具有促凋亡及促炎、促纤维化作用。吕天宜等[13]总结近年研究发现，慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤及肺纤维化等多种呼吸系统疾病的发生机制中，都有p38MAPK信号通路活化磷酸化参与炎症反应、介导纤维沉积及氧化活动。和厚朴酚、虎杖苷、朝医麻黄定喘汤等均可以通过抑制p38MAPK的过度表达，激活调节p38MAPK/Nrf2/HO-1通路来抑制炎症反应，且效果显著[14-16]。本实验结果显示，模型组大鼠肺组织中p38MAPK蛋白表达量明显高于正常组，平肺口服液组大鼠肺组织中p38MAPK蛋白表达量明显低于模型组，说明平肺口服液可下调p38MAPK表达，从而抑制炎症反应。

综上，平肺口服液可上调HO-1、Nrf2表达，下调p38MAPK表达，该药可能通过调控p38MAPK/Nrf2/HO-1信号通路发挥治疗急性RILI的作用。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。