基于刺突蛋白靶点的抗新型冠状病毒药物研究进展

耿嘉懿，孙 浩，倪 强，李秋钰

北京大学第三医院呼吸与危重医学科，北京 100191

新型冠状病毒肺炎(the coronavirus disease 2019，COVID-19)的大流行已经在全球范围内造成了累计近4亿人感染和超过500万人死亡，给社会经济造成了沉重负担。重症急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是造成COVID-19的病原体，该病毒与2003年在我国引起传染性非典型肺炎的病毒具有较高同源性，同属于β冠状病毒家族[1-3]。SARS-CoV-2的严重感染可引起急性呼吸窘迫综合征，并发心肌、肝脏、肾脏等多脏器损害及败血症等症状，最终导致患者死亡。

结构生物学研究显示，SARS-CoV-2衣壳上的刺突(spike，S)蛋白是介导病毒与宿主细胞受体结合、进而介导病毒入侵宿主细胞的关键表面蛋白；S蛋白含有S1和S2两个亚基，S1亚基含有受体结合结构域(receptor binding domain，RBD)，是S蛋白与宿主细胞受体直接结合的结构域；S2亚基则含有融合肽(fusion peptide，FP)、七肽重复区(heptad repeat region，HR)1和2等，是膜融合过程所需的基本元件。感染过程中，S蛋白在经宿主细胞蛋白酶水解后，暴露RBD，进而与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)2受体结合，通过胞吞作用进入宿主体内[4-6]。因此，S蛋白在病毒与宿主细胞接触、受体结合以及病毒-宿主细胞膜融合过程中起着关键作用，而针对S蛋白的抑制剂可以阻断病毒与受体结合的过程，缓解病情，为治疗争取时间。本文基于S蛋白靶点，对抗新型冠状病毒药物的研究进展进行阐述。

蛋白及多肽类

以S1亚基为靶点的抑制剂基于ACE2设计的抑制剂是该类抑制剂中的重要部分。有案例报道重组人源ACE2有效降低了COVID-19患者血浆中的病毒载量和炎症因子水平，并且对肺等器官起到了保护作用[7]；但在Ⅱ期临床试验中，重组人源ACE2似乎仅在保护心、肝器官方面发挥了微弱的作用[8]。基于ACE2序列设计出的短肽，如基于ACE2设计的变体1(AHB1)、基于ACE2设计的变体2(AHB2)、ACE 2 衍生七肽(GK-7)等[9-10]，能够以微摩尔的亲和力与RBD结合。ACE2的胞外结构域与免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)重组成ACE2-IgG融合蛋白，在生物体内更为稳定，多种ACE2-IgG1-可结晶段(fragment crystallizable，Fc)融合蛋白已经在体外实验中显示出良好的效果[11-15]，由复宏汉霖公司生产的ACE2-IgG1-Fc融合蛋白已经进入临床试验阶段[16]。Svilenov等[17]发现，将重组蛋白的IgG1-Fc替换为IgG4κ-Fc并引入S228P突变，能够进一步降低补体激活和抗体介导的细胞毒性反应并延长融合蛋白的半衰期，为融合蛋白的优化提供了新思路。另外，利用HEK-293T-hACE2细胞获得的含hACE2的囊泡也已经在动物实验中显示出对SARS-CoV-2强大的中和能力[18-19]。

除ACE2外，人体内一些其他蛋白也能够与S1亚基结合，进而阻断S-ACE2相互作用。人肺表面活性蛋白D是凝集素家族中的一种糖蛋白，在机体免疫中发挥着重要功能[20-21]。研究发现，重组人源肺表面活性蛋白D片段可以通过其糖类识别结构域与SARS-CoV-2的RBD结合[22-23]。LL-37是人体中发现的抗菌肽cathelicidin家族中的唯一成员，也是人体内唯一的双亲性α螺旋结构的抗菌肽，在机体免疫中扮演着重要角色[24]。Wang等[25]研究发现，LL-37能够同时与S蛋白的RBD结构域和ACE2结合，从而双向阻断S-ACE2的相互作用。ATN-161是一种由纤连蛋白衍生出的五氨基酸短肽，研究发现，ATN-161可以通过两种方式抑制SARS-CoV-2：一是直接与S1亚基结合干扰其构象，掩盖S1亚基与ACE2的结合位点[26]；二是通过结合整合素，干扰S蛋白与整合素或ACE2/整合素复合物的结合[27]。

这些结果提示我们从人体自身固有的蛋白出发，寻找SARS-CoV-2抑制剂是新冠药物开发的重要方向。也有研究通过模拟计算的方式，从头设计出具有S蛋白结合潜力的短肽或蛋白，但其实际效果仍需进一步验证[9]。

以S2亚基为靶点的抑制剂复旦大学研究团队设计出一种针对人冠状病毒刺突HR1结构域的泛冠状病毒融合抑制剂——基于人冠状病毒OC43的HR2设计的优化变体1(EK1)，EK1能够竞争性结合HR1、阻断6-HB的形成而抑制S蛋白介导的细胞融合，从而阻断多种冠状病毒[28]。由于冠状病毒的S2亚基高度保守，EK1同样能够有效抑制SARS-CoV-2[29]。对EK1进行酯化修饰后得到的EK1C4显示出了更强的抑制能力[29]，而将EK1C4的四聚乙二醇基团替换后得到的脂肽EKL1C，虽然对SARS-CoV-2的抑制能力略有降低，但具有更高的稳定性[30]。该团队还曾根据SARS-CoV-2的HR2序列设计出一种衍生肽HR2P，能够以相似原理阻断S蛋白介导的细胞融合[31]。也有其他研究者基于SARS-CoV-2的HR2序列设计并优化得到了脂肽，如SARS-CoV-2 HRC脂肽[32]和IPB02等，这些研究中经酯化修饰后的脂肽均显示出对SARS-CoV-2更强的抑制能力，这些结果提示基于SARS-CoV-2的HR2序列设计短肽并进行酯化修饰是开发SARS-CoV-2抑制剂的可行方案，但这些脂肽的实际效果和安全性仍需要进一步的验证[33]。

糖基化酶抑制剂糖基化是一种非常普遍但也十分重要的蛋白修饰方式，主要包括N-连接、O-连接、C-连接和糖基磷脂酰肌醇锚定4种方式，以N-连接为主[34]。糖基化修饰对病毒的蛋白质折叠、受体识别、传染性和免疫逃避起着重要作用[35]。SARS-CoV-2的S蛋白是一种高度糖基化的糖蛋白，具有22个N-糖基化修饰位点[36]。研究发现，抑制宿主细胞的糖基化过程虽然不能直接抑制S-ACE2相互作用，但能够明显降低SARS-CoV-2对细胞的感染速率，并使大量病毒颗粒失去感染能力[37-38]。体外细胞学实验已经证实，α-葡萄糖苷酶抑制剂(包括NGI-1、麦格司他、西戈斯韦等)能够有效降低SARS-CoV-2侵染细胞的速率，并且对多种变异毒株都有很好的效果[38-39]。但α-葡萄糖苷酶抑制剂发挥作用较慢，无法在第一时间阻断病毒入侵，因此可能更适合作为已感染患者联合用药的选择；此外，α-葡萄糖苷酶抑制剂可能会引起胃肠道反应，需要进一步的临床试验来证实其疗效和患者的耐受性。

小分子抑制剂

小分子抑制剂是一类分子量较小的化合物，相较于抗体和大分子药物，小分子抑制剂被认为具有更好的抗病毒逃逸能力和更低的免疫原性[40]，也成为新冠药物的研究热点之一。

S-ACE2的结合需要硫酸乙酰肝素的辅助[41]。而肝素可以竞争性结合RBD，进而抑制病毒入侵细胞；另外，肝素还可以与S2亚基水解切割位点相互作用，进一步抑制S蛋白的膜融合步骤[41-43]。因此，肝素除可用于预防COVID-19患者血栓形成外，还具有直接阻断病毒感染的潜力[44]。但由于应用肝素具有出血风险，因此其临床应用需要进一步评估。基于肝素开发出血风险更小、结合病毒能力更强的化合物，是药物开发设计方向之一[45]。

Shi等[46]研究发现，两种巯基化合物P2119和P2165能够将S蛋白的二硫键还原，影响S蛋白的构象，从而阻断其与ACE2的结合。两种化合物的半最大效应浓度(concentration for 50% of maximal effect，EC50)分别达到了22 ng/ml和37 ng/ml。这项研究立足于全新的S蛋白靶点，为药物开发提供了新的方向。

许多研究者通过计算机模拟(分子对接和分子动力学模拟)，对数据库中的小分子化合物进行筛选，以寻求潜在的SARS-CoV-2抑制剂。Power等[47]针对S蛋白的Lys31和Lys353氨基酸残基附近区域进行筛选，得到了数种具有潜在抗病毒能力的化合物，其中ZINC02111387活性最强，EC50为1.12 μg/ml。基于RBD-ACE2结合界面的结构，筛选出的MU-UNMC-1、MU-UNMC-2、Q34[48-49]，其半抑制浓度(the half maximal inhibitory concentration，IC50)分别为0.67、1.72、14.40 μmol/L。计算机辅助的应用，大大缩短了药物筛选和开发时间，为应对病毒的快速变异提供了有力工具，如Khan等[50]通过计算机模拟，筛选出能够与Omicron毒株的S蛋白形成稳定化学键的C1～4 4种化合物；Bharathi等[51]从藻类中筛选出具有抑制Omicron毒株潜能的咖啡酸己糖苷和根皮素，为应对快速传播的Omicron毒株提供了参考。

中草药及其活性成分

中药在COVID-19的治疗中发挥了重要作用。Kang等[52]对中药治疗COVID-19的临床研究进行了系统综述，结果表明中药能够有效降低患者由轻症进展至重症的比例，降低重症患者的死亡率，并能有效改善患者症状，缩短患者住院时间和核酸转阴时间。目前应用较为普遍的中药有“三药三方”(清肺排毒方剂、宣肺败毒方剂、化湿败毒方剂、连花清瘟胶囊、金花清感颗粒、血必净注射液)、疏风解毒方剂、双黄连口服液等[52-54]。而中药及其活性成分的作用机制也已成为研究热点。

多数研究认为，中药的治疗作用主要来源于其活性成分对炎症的抑制作用[53]。但随着研究的深入，许多研究也发现中药及其活性成分能够通过靶向S蛋白而抑制病毒侵入。甘草、麻黄是上述提及的中药方剂中最为常见的组分。甘草中含有的甘草酸、甘草三萜皂苷(A3)、甘草次酸能够与S蛋白的RBD结合，IC50分别为22、8.3、10.9 μmol/L；在细胞学实验中，甘草次酸的50%有效浓度(concentration for 50% of maximal effect，EC50)为3.17 μmol/L，而A3由于还可以抑制病毒核酸复制所需的nsp7蛋白，其EC50达到了惊人的75 nmol/L[55-56]。麻黄提取物中分离出的3种活性成分4，6-二羟基喹啉-2-羧酸、4-羟基喹啉-2-羧酸和4-羟基-6-甲氧基喹啉-2-羧酸能够与RBD结构域中的受体结合基序结合，体外试验测得3种化合物的IC50分别为1.09、0.44、0.75 μmol/L[57]。

此外，还有许多中草药及其活性成分也被发现靶向S蛋白，这为开发新的中药方剂及根据成分设计新药提供了参考。如从何首乌中提取的表没食子儿茶素没食子酸酯能够结合S蛋白的RBD，其IC50测得为30 μmol/L[58]。从叶下珠中提取的有机成分柯里拉京能够结合到S蛋白Cys336-Phe374残基形成的口袋结构，其IC50为24.9 μmol/L[57]；许多中草药中都含有的1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖能够结合到S蛋白Glu340-Lys356残基形成的口袋结构中，阻断S-ACE2相互作用，其IC50测得为46.9 μmol/L[59]；千金藤碱、草果精油、石榴皮提取物、蒲公英提取物也被发现能够与S蛋白结合[60-63]。不过，这些中药及植物提取成分的结合能力相对较弱，多在微摩尔级，而且其效果需要进一步的动物模型和临床试验的证实。

老药新用

部分已经上市的“老药”被发现能够抑制SARS-CoV-2。如Hu等[64]发现，抗丙型肝炎病毒药物氯环利嗪能够结合到S2亚基FP结构域的疏水口袋中，又进一步针对该位点进行药物筛选，发现抗组胺药物氯苯托品和促甲状腺素受体的变构调节剂D3-βArr两种化合物及其类似物能够抑制SARS-CoV-2；抗真菌药物伊曲康唑、雌激素类药物苯甲酸雌二醇和抗人类免疫缺陷病毒药物奈菲那韦也被发现能与S2亚基结合[65-66]。抗哮喘药物孟鲁斯特、扎鲁斯特，抗真菌药物联苯苄唑能够与RBD稳定结合，阻断RBD-ACE2相互作用[67-69]。这些“老药”，不仅对新药的设计研发具有启示意义，更有着作为COVID-19治疗辅助用药的潜力。而且，“老药”多已经过了临床应用，其安全性、不良反应、药代动力学特点等较为明确，能够更便捷地应用于临床。

此外，还有一些很新颖的药物研究方向，如含金属化合物[70]等。

结 语

综上，S蛋白是SARS-CoV-2感染的关键组分，因此靶向S蛋白的药物具有很高的开发价值。许多人体内固有的蛋白能够与S蛋白结合，基于这些固有蛋白进行药物的设计研发能够大大节省时间和经济成本。此外，小分子复合物、中药及植物提取成分以及老药新用都是开发药物的潜力方向。