基于小鼠肺组织蛋白质组学预测哮喘发病机制及潜在治疗靶点

支文冰，刘 洋，李 晔，许宗仁，姜盛楠，周 洁，孟 雪，张 红

1陕西省中医药研究院(陕西省中医医院)中药研究所，西安 710003 2陕西中医药大学药学院，陕西咸阳 712046

支气管哮喘是指由多种细胞(如嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、B淋巴细胞、肥大细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[1]。2019年，我国最大规模哮喘研究结果显示中国有超4500万成人患有哮喘，并且呈现逐年增多的趋势[2]。根据临床症状可将哮喘分为急性发作期、慢性持续期和临床缓解期[3-4]。临床上主要采用吸氧、抗炎、补液、解痉、平喘等方法治疗哮喘[5]，在急性发作期常用的药物有β2肾上腺素受体激动剂、茶碱类药物、抗胆碱药物、糖皮质激素以及控制感染的抗生素[6]；临床缓解期首选吸入性糖皮质激素、长效β2肾上腺素受体激动剂等[7]，但是糖皮质激素每天需限量使用，且不宜长期使用。目前，哮喘的发病机制主要有炎症-免疫反应学说、气道神经调节机制学说和遗传学说等[8]，抗IgE单克隆抗体、P2受体激动剂和抗白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)单克隆抗体等生物制剂拓宽治疗哮喘的药物范围[9]，但哮喘的发病机制尚未完全阐明，有效的作用靶点缺乏系统的挖掘和阐述。因此，探究哮喘发病机制、系统地寻找药物作用靶点是亟待解决的问题。

蛋白质组学基于整体观念可实现动态解析机体蛋白质的表达，通过定量不同状况下细胞、组织或器官中蛋白质水平，发现药物作用、病理变化及环境改变等条件下蛋白质种类、浓度、前后修饰形式的变化，进而对疾病的复杂过程进行深入和全面的认识[10-12]。蛋白质组学是目前探究疾病发生、了解病因、早期诊疗及预后的重要手段。网络药理学作为一种系统性阐述药物活性成分和作用机制的研究方法，利用网络互助图形象展示疾病相关作用靶点、疾病-成分-靶点的关系网络，是复杂体系活性成分筛选的良好手段[13]。本课题组前期成功建立了卵清蛋白(ovalbumin，OVA)诱导的小鼠哮喘模型，采用蛋白质组学技术分析了模型组、空白组和槐果碱给药组小鼠肺组织中的差异蛋白，揭示了槐果碱抗哮喘作用机制[14]，但哮喘模型的蛋白质组学结果没有深入挖掘，其差异蛋白也没有深入分析。因此，本研究以蛋白质组学实验结果为基础，联合网络药理学分析哮喘发病所涉及的生物学过程、靶点细胞成分、分子功能，预测哮喘潜在的核心作用靶点，并对哮喘发病、发展可能涉及的信号通路进行阐述，为哮喘治疗药物的设计及临床治疗提供数据支持。

材料和方法

软件和数据库UniProtKB数据库(https：//www.uniprot.org)、String数据库(https：//string-db.org)、DAVID数据库(https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp)、Venny2.1数据库(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)、Cytoscape3.6.1软件和MeV 4.9软件。

材料与动物OVA和氢氧化铝凝胶购买于美国Sigma 生物试剂有限公司。实验BALB/c小鼠为SPF级雌性小鼠，体重18～22 g，购买于西安交通大学实验动物中心[SCXK(陕)2020-005]，饲养于陕西省中医药研究院实验动物中心。

哮喘模型建立及蛋白质组学检测将SPF级雌性小鼠(18～22 g)分为哮喘模型组和空白组，OVA 氢氧化铝诱导致敏，5% OVA溶液激发，建立哮喘模型。获取各组小鼠肺组织，进行蛋白提取和酶解，采用非标定量法技术进行蛋白质组学鉴定，具体实验方法同文献[14]。

差异基因热图及火山图分析将质谱数据通过Maxquant(版本：1.6.0.16)搜索引擎，以NCBI小鼠(76 770个蛋白条目)库为数据库，按照Maxquant默认设置母离子和子离子误差设置为20 ppm，可变修饰如下：乙酰基(蛋白质N端)氧化处理，固定修饰设置为半胱氨酸脲甲基化；酪蛋白酶全酶切，酶解片段允许最多有2个漏切位点，肽段和蛋白水平的错误发现率质控为1%检索。采用Maxquant的非标记定量蛋白组学分析定量值iBAQ，利用单个蛋白的iBAQ定量值除以全部样品的iBAQ值的加和得到最终的定量值FOT。采用GraphPad Prism 5.01软件进行方差分析判定组间差异，以模型组中各基因表达值(M)/空白组中各基因表达值(C)≥2且P≤0.05；M/C≤1/2且P≤0.05为差异基因筛选条件，利用MeV4.9软件将方差分析结果进行聚类分析，得到热图。同时，采用GraphPad Prism 5.01软件进行t检验，以M/C≥2且P≤0.05；M/C≤1/2且P≤0.05为差异基因筛选条件，利用MeV4.9软件将两两对比结果制备散点图。

蛋白互作网络构建将以M/C≥2且P≤0.05、M/C≤1/2且P≤0.05为条件筛选得到的差异基因输入STRING数据库，设置组织来源为人源，得到蛋白互作图。将蛋白相互作用关系文件导入Cytoscape 3.6.1软件进行拓扑异构学分析。以连接度≥中位数为条件，筛选得到核心靶标，进一步制备蛋白互作图。

京都基因与基因组百科全书通路注释分析以M/C≥2且P≤0.05或M/C≤1/2且P≤0.05筛选得到的差异基因分别输入DAVID数据库，进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信号通路富集和基因本体(gene ontology，GO)功能分析。同时，将KEGG结果导入MeV4.9软件进行标注。

GO富集及生物学过程分析利用Excel软件将GO富集结果以度值降序排列，筛选得到分子功能、细胞组分和生物学过程结果。将生物学过程分析结果导入Cytoscape 3.6.1软件，建立靶点-生物过程网络，以度值≥1为条件，筛选得到生物过程重要参与基因，并进行颜色区分标注。

抗哮喘靶点垂钓以M/C≥2且P≤0.05或M/C≤1/2且P≤0.05为条件筛选得到的M/C定量比值排列前5的差异基因作为蛋白质组学有较大差异的基因。采用Venny2.1数据库合并蛋白互作分析筛选得到的核心靶点、生物学过程重要靶点和蛋白质组学有较大差异的基因，得到韦恩图。

结 果

聚类分析以M/C≥2且P≤0.05、M/C≤1/2且P≤0.05为条件筛选得到的差异基因共904个，聚类分析显示，这些基因主要分为3个簇。簇1代表模型组和空白组有组间差异但是基因表达水平均较低；簇2代表模型组与空白组比较基因表达水平提高；簇3代表模型组与空白组比较基因表达水平降低(图1)。

簇1：模型组与空白组基因表达量均较低；簇2：模型组较空白组基因表达显著升高；簇3：模型组较空白组基因表达显著降低

火山图分析从蛋白质组学分析得到5063个基因；采用t检验，以log2(M/C)≥1且-log(P)≥1.3或log2(M/C)≤-1且-log(P)≥1.3为条件筛选得到基因集1和2。基因集1为模型组较空白组比较下调基因，共595个；基因集2为模型组较空白组比较上调基因，共309个；其他均为差异无统计学意义的基因(图2)。

基因集1：模型组较空白组比较下调基因；基因集2：模型组较空白组比较上调基因

蛋白互作网络分析利用STRING平台，分别以M/C≥2且P≤0.05，M/C≤1/2且P≤0.05为条件将蛋白质组学的结果进行筛选，将筛选得到的904个差异基因进行蛋白互作分析，来源设置为人源，研究显示其中838个靶标可以发生相互作用，包含5722条边，平均靶点的度值为13.7，以≥中位数为筛选条件，共得到20个核心靶标，包括ITGAM、VEGFA、MMP-9、STAT1、CD44和MYD88等。将20个核心靶标重新构建蛋白互作网络(图3)。20个核心靶标的网络拓扑学分析结果显示，排列前5的靶点分别为PTPRC、ITGAM、VEGFA、ITGB2、MMP9，其度值依次为106、101、95、83和79(表1)。

表1 哮喘治疗核心靶点及其拓扑性质

颜色从绿色到蓝色依次代表度值由小到大，箭头的大小与度值成正比

KEGG通路分析将蛋白质组学筛选得到的595个上调蛋白和309个下调蛋白(模型组与空白组相比)分别进行生物信息学注释，结果显示模型组小鼠肺组织中上调基因主要富集到代谢信号通路、溶酶体、Fc gamma R介导的吞噬、白细胞内皮迁移、肿瘤坏死因子信号通路、Toll样受体信号通路和B细胞受体信号通路，这些信号通路多与哮喘炎症增强相关(图4A)。模型组小鼠肺组织中下调基因主要富集到磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K-Akt)信号通路、细胞外受体相互作用、血管平滑肌收缩、细胞黏附和抑郁等相关通路，此信号通路多与哮喘气道重塑相关(图4B)。

KEGG：京都基因与基因组百科全书

GO功能分析将蛋白质组学上调及下调基因分别进行GO分析，结果显示模型组与空白组相比，富集上调基因和下调基因均具有的分子功能包括结合蛋白和蛋白质同质化作用；富集上调基因分子功能独有结合ATP、结合poly(A)RNA、识别蛋白和结合蛋白激酶，富集下调基因分子功能包括绑定金属离子、结合钙离子、结合肌动蛋白和结合钙黏蛋白参与细胞与细胞的黏附。模型组与空白组相比，富集上调基因和下调基因均承担的细胞成分包括细胞外外来体、细胞质、细胞质基质和细胞膜；富集上调基因承担的细胞成分有细胞核质和细胞外间隙，富集下调基因承担的细胞成分包括细胞膜组成成分(图5)。

GO：基因本体分析

GO生物学过程分析基于蛋白质组学差异基因结果可知，模型组与空白组相比，富集上调基因和下调基因均参与生物学过程包括信号转导和氧化还原过程；此外，富集上调基因参与生物学过程包括免疫应答、细胞凋亡和炎症反应，富集下调基因参与生物学过程包括细胞黏附、GTP酶活性正调控、胞内信号转导和细胞外基质形成过程等(图6)。其中参与1个以上生物学过程的基因共64个。

A.模型组较空白组上调基因的生物学过程分析；B.模型组较空白组下调基因的生物学过程分析

哮喘潜在的治疗靶点解析与空白组相比，模型组上调基因差异排列前5的依次为Asprv1、Fcgr2b、Il1rn、Acod1和Ms4a4a；与空白组相比，模型组下调基因差异排列前5的依次为Rhob、Vegfa、Comp、Cdc42se2和Crb3(表2)。20个核心基因、生物学过程64个重要基因和10个蛋白质较大差异的基因合并显示，3个部分没有共同基因，其中生物学过程重要基因和核心基因有6个靶点交集，分别为ITGB3、CYBB、SYK、VWF、ITGB2和MYD88；生物学过程重要基因和蛋白质较大差异的基因有2个靶点交集，分别为COMP和FCGR2B；核心基因和蛋白质较大差异的基因有1个靶点交集，为VEGFA(图7)。

图7 哮喘潜在治疗靶点筛选

表2 基于蛋白质组学分析的模型组较空白组上调和下调的前5个基因

讨 论

支气管哮喘是一种常见的慢性呼吸道性疾病，过敏原、心理应激和PM2.5等因素均可诱导哮喘的产生和加重，其病程长，反复发作；发病率在1%～18%，我国成人哮喘发病率11%，呈逐年上升趋势[15-16]。然而哮喘发病机制复杂，尚未阐明。近年来，随着网络药理学和蛋白质组学技术的出现，拓宽了疾病及复发潜在作用机制的研究，本研究联合大通量数据和大数据库系统针对哮喘的发病机制及潜在作用靶点进行系统地阐述。生物学过程反映了机体细胞的生长、代谢和遗传等，通过分析靶点参与的生物学可以有效解读疾病发生和发展的过程。本研究显示哮喘发病机制涉及多种生物学过程，主要以炎症反应和免疫应答为基础，涉及细胞凋亡和信号转导过程；同时，细胞黏附和细胞外基质形成是影响哮喘患者气道重塑的重要生理过程。有研究显示红景天苷通过下调NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎性小体进而降低哮喘小鼠肺泡灌洗液中炎症因子IL-1β、IL-4、IL-13、IL-17A和IL-33的水平，发挥抗哮喘作用[17]。哮喘患者外周血呈现T细胞介导的免疫细胞因子失衡，且与钠尿肽受体A mRNA、GATA结合蛋白3 mRNA表达上调有关[18]。无论是哮喘患者或哮喘动物模型，在诊断中发现支气管上皮细胞和平滑肌细胞均存在细胞凋亡[19-20]。本研究再次论证炎症-免疫反应在哮喘病变过程中的重要作用，同时发现多个基因参与细胞内外的信号转导；GTP酶活性的正调控机制也是哮喘发病的重要生物学过程。

信号通路如肿瘤坏死因子信号通路[21-22]、Toll样受体信号通路[23-24]、B细胞受体信号通路[25]和PI3K-Akt信号通路[26]等在哮喘发病机制的阐明方面多有报道。哮喘患者代谢组学研究表明肠道微生物活性代谢物和血清代谢物水平升高，可能激活多个抗炎途径缓解哮喘[27]。本研究显示哮喘发病机制涉及的信号通路还包括溶酶体活性、Fc gamma R介导的吞噬、白细胞内皮迁移、胞外受体相互作用、血管平滑肌收缩、细胞黏附和抑郁等相关通路，这些信号通路多与哮喘炎症增强和气道重塑相关。通过整合蛋白质组学定量差异较大的基因、蛋白互作核心靶点及富集生物学过程重要靶点，共筛选出9个抗哮喘作用的潜在靶点，分别为ITGB3、ITGB2、CYBB、SYK、VWF、MYD88、COMP、FCGR2B和VEGFA；其中基因ITGB3、ITGB2、CYBB、SYK、MYD88、FCGR2B和VEGFA在哮喘发病机制、诊断标志物及动物模型相关的研究报告较为丰富，是国内外已报道的重要的哮喘治疗靶点；而VWF和COMP基因相关研究较少。血管性血友病因子(基因：VWF)作为内皮损伤标志物，研究显示在重度哮喘患者和儿童哮喘患者血清中呈高表达，可作为重度哮喘诊断标志物[28-29]。软骨寡聚基质蛋白(基因：COMP)为细胞外基质中的非胶原糖蛋白，其多在骨关节系统病变、心血管系统疾病、组织纤维化和癌症等疾病发生过程中发挥作用，而鲜有报道与哮喘相关[30]。综合分析上述9个基因显示，COMP、SYK、VWF、ITGB3和VEGFA均为PI3K-Akt信号通路重要的调控蛋白。整合素β3(基因：ITGB3)作为细胞纤维连接蛋白、层粘连蛋白、基质金属蛋白酶2、骨桥蛋白和骨调节蛋白的受体，早期研究显示整合素3基因型影响哮喘和过敏表型[31]；整合素β1基因沉默抑制哮喘模型小鼠支气管平滑肌细胞的增殖、降低分泌功能并促进平滑肌细胞凋亡[32]。细胞色素B-245重链(基因：ITGB3)是呼吸链的末端组成部分，将单个电子从细胞质NADPH穿过细胞膜转移到外部的分子氧，作为一个电压门控质子通道，是吞噬细胞中产生超氧化物的膜结合氧化酶的关键成分，其作用在哮喘治疗较少报道，但是与神经炎症等炎症性病变相关[33-34]。酪氨酸受体激酶SYK(基因：SYK)调节多种生物过程，包括先天和适应性免疫、细胞黏附、介导树突状细胞的活化和肥大细胞的激活[35-36]。血管生长因子A(基因：VEGFA)调控细胞迁移和凋亡，嗜酸性粒细胞表型哮喘患者的血清及诱导痰中的表皮细胞生长因子、重组人源血管内皮生长因子水平显著升高[37]。低亲和力免疫球蛋白Fc区受体2B(基因：FCGR2B)是复合或聚集的免疫球蛋白的Fc区受体，参与吞噬免疫复合物和调节B细胞产生抗体，是哮喘嗜酸性粒细胞的相关性指标[38-39]。髓系分化因子88蛋白(基因：MyD88)是先天免疫反应中Toll样受体和IL-1受体信号通路的适配器蛋白，通过IL-1受体相关激酶1、IL-1受体相关激酶2、人干扰素调节因子7和肿瘤坏死因子受体相关因子6作用，导致NF-κB激活，影响细胞因子分泌和炎症反应。TLR4/MyD88信号通路与气道上皮细胞损伤、炎症反应和MUC5AC高分泌相关[40]。基于文献查阅和蛋白质组学结果，本研究重点从靶点、信号通路及生物学过程系统揭示哮喘的发病机制，为抗哮喘药物的研发和临床治疗提供数据支撑。