抗病毒药物中间体替诺福韦的合成工艺研究

尚胜捷，王 璨，陈云峰

武汉工程大学化学与环境工程学院，湖北 武汉 430205

替诺福韦（tenofovir，PMPA）于1993年被发现具有抗核苷酸逆转录的作用，具有很好的抗病毒效果［1］，但是由于其使用过程中具有肾毒性等副反应问题，基于此作为前药，陆续开发了一些新的核苷类抗病毒药物，吉利德公司开发的富马酸丙酚替诺福韦（tenofovir alafenamide fumarate，TAF）和富马酸替诺福韦酯（tenofovir disoproxil fumarate，TDF）分别于2016年和2008年被FDA批准用于治疗乙肝（hepatitis B virus，HBV）和人类免疫缺陷病（human immunodeficiency virus，HIV），其在体内通过代谢形成R-9-（2-磷酸甲氧基丙基）-腺 嘌 呤［R-9-（2-phosphonylmethoxypropyl）-adenine，PMPA］的前药而发挥抗病毒作用，值得注意的是，它们的化学合成的核心中间体为PMPA［2］。另外，近期也有报道PMPA可直接用于治疗严重急性呼吸征冠状病毒感染［3-5］。鉴于PMPA在医药领域的重要性，其合成工艺备受关注。

1999年，吉利德公司首次报道了合成PMPA的商业路线［6］，总收率为13%，随后经过优化，使总收率提高到24%（图1）［7-8］。整条反应路线是以腺嘌呤和碳酸丙烯酯为起始原料的，然而由于腺嘌呤分子上的6号位氮原子和9号位氮原子竞争，反应的选择性较差，最终导致目标分子N9-（2-羟基丙基）腺嘌呤（5）产率降低。1990年，Proenc等［9-10］报道了以二氨基马来腈（1）为起始原料，合成咪唑衍生物的方法，在此基础上，2020年，Derstine等［11］报道了以1为起始原料合成5的非核苷路线，该条路线巧妙的避免了6号位氮原子和9号位氮原子的竞争，手型异丙醇骨架在合成咪唑环前被安装到分子中，并且保留了手型结构，这个方法为合成PMPA提供了新的选择。同时，该方法也有较大的优化空间，相关的产物后处理较为繁琐不适于工业生产，可以对后处理进行优化，使其更适合工业化生产；另外，作者使用较为昂贵的三甲基溴硅烷（trimethylbromosilane，TMSBr）等试剂，可以通过优化反应条件，使用更为经济的试剂，有利于降低合成成本。

图1 吉利德公司报道的替诺福韦合成路线Fig.1 PMPA synthesis route reported by Gilead

从5合成PMPA的方法也有较多报道。2010年，Brown等［12］使用叔丁醇镁作为碱，将5烷基化（图2式1）；在第一步过程中，烷基化可以在极性非质子溶剂中进行，其中，N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、N-甲基吡咯烷酮（N-methylpyrrolidone，DMP）效果最好，但由于DMF存在游离的二甲胺，会导致一些二甲酰磷酰胺产生，故作者选用NMP作溶剂。在第二步合成过程中，作者使用路易斯酸催化亚磷酸二乙酯脱烷氧基，用三甲基氯硅烷（trimethylchlorosilane，TMSCl）代替较昂贵的TMSBr；在此步骤中，并不需要分离出中间产物N9-［（2-羟甲基亚磷酸二乙酯）丙基］-腺嘌呤（8）。2016年，Riley等［13］使用甲基格式试剂和叔丁醇体系，将5烷基化（图2式2）；在第一步烷基化过程中，由于叔丁醇镁的价格过高，并且过量镁离子与8络合形成少量副产物，因此作者使用甲基格氏试剂代替叔丁醇镁作为碱。作者并没有对亚磷酸试剂进行筛选，是因为Mg2+与8络合，使得5更容易烷基化［14］。使用环己烷做为溶剂，更容易提纯中间产物8。在第二步水解过程中，作者使用氢溴酸和醋酸体系做水解。综上所述，因为氢溴酸的毒性和反应体系的除水难度，以及三甲基溴硅烷是一种较为昂贵的水解试剂，本文使用已经报道过的TMSCl和溴化钠（sodium bromide，NaBr）体系先把对甲苯磺酰基甲氧基亚膦酸二乙酯（9）水解［11］，再进行5的烷基化，降低了反应危险和生产成本，适合工业生产。

图2 替诺福韦的合成路线Fig.2 Synthesis route of PMPA

为了解决传统合成工业遇到的问题和提供可供选择的工艺合成路线，通过文献对比，本文选择1为起始原料，避免使用腺嘌呤来合成PMPA；另外，最后一步合成中使用更经济的碱和优化反应的后处理，进一步控制合成成本。综上所述，选择以下合成方案（图3）。

图3 替诺福韦的合成方案Fig.3 Proposed synthesis scheme of PMPA

1 实验部分

1.1 化学试剂及材料

1.1.1 主要化学仪器Varian 600 MHz以及400 MHz核磁共振仪（TMS做内标）；RY-1型熔点仪；FINNIGAN TRACE MS和BRUKER APEX IV FTMD质谱仪；DF101S集热式恒温加热磁力搅拌器；IKA旋转蒸发仪。

1.1.2 化学试剂二氨基马来腈（纯度≥98%，国药试剂）；异丙醇胺（纯度≥98%，优索试剂）；氢氧化钡（纯度≥98%，天津大茂化工试剂）；醋酸甲脒（纯度≥98%，麦克林试剂）；三甲基氯硅烷（纯度≥99%，麦克林试剂）；叔丁醇钠（纯度≥98%，国药试剂）；对甲苯磺酸酰基甲氧基亚磷酸二乙酯（纯度≥98%，麦克林试剂）；氯化镁（纯度≥98%，国药试剂）；N，N-二甲基甲酰胺（纯度≥99%，天津富宇试剂）；乙腈（纯度≥99%，天津富宇试剂）。

1.2 实验方法

1.2.1 N-亚甲胺基-（2-氨基-1，2-二氰基乙烯基）乙酯（2）的合成称取20 g原料1于250 mL的烧瓶中，加入80 mL的乙醇，常温下搅拌5 h。再将25 mL原甲酸三乙酯一次性滴加进反应中。将126.5 mg的三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）加入反应中（注意此过程需要严格控制TFA的量，若滴加过量，则会导致产物粘结而难以搅拌）。反应在油浴锅中加热至40℃反应2 h。反应完毕后，在20 min内冷却至室温，继续冷却至反应内部温度0℃。通过真空过滤分离固体，得到的固体在真空下干燥。反应最终得到26.2 g浅灰色固体，产率为94.2%。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ8.21（s，1H），4.05（s，2H），3.57（s，3H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ157.37，123.53，115.26，115.12，98.79，55.10。

1.2.2 N-（2-羟丙基）-4-氰基-5-氨基咪唑（4）的合成在250 mL的圆底烧瓶中加入14.4 mL异丙醇胺，用20 mL乙腈溶解，室温下搅拌5 min。将20 g原料2溶解于140 mL乙腈中，并一次性加入反应中，此时反应液变为深红色，用额外12 mL乙腈冲洗瓶壁上的残留固体反应2.5 h。原料2消耗完毕后，使用冰水浴将反应混合物冷却至0～5℃，加入30.4 g氢氧化钡和72 mL蒸馏水。随后将反应加热至40℃，反应液变为深棕色，反应1.5 h。反应完全后，反应混合物通过布氏漏斗过滤，在40℃下减压脱去溶剂，产物以黑油状液体留在烧瓶中。在黑油产物中添加氢氧化钡的饱和800 mL乙醇溶液，常温下搅拌过夜（约12 h）。抽滤反应液除去钡盐沉淀，40℃下减压脱去溶剂，得到的固体在真空下干燥，最终得到浅灰色固体产物18 g，产率81.4%。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ7.11（s，1H），6.08（s，2H），5.06（d，J=4.9 Hz，1H），3.87～3.74（m，2H），3.68～3.58（m，1H），1.05（d，J=6.2 Hz，3H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ148.37，134.00，118.07，90.71，65.36，50.62，21.07。

1.2.3 N9-（2-羟基丙基）腺嘌呤（5）的合成在250 mL圆底烧瓶中加入27.8 g原料4和醋酸甲脒29.5 g，将混合物溶于100 mL的DMF中。加热混合物至内温100℃，反应过夜（约12 h）。反应完全后，关闭加热并加入异丙醇150 mL，将反应液冷却至室温（25℃）。再将反应液冷却至-15℃的内温，在此温度下搅拌3 h。过滤悬浮液，用80 mL冷的异丙醇洗涤固体，将分离出的固体置于真空烘箱中干燥2 h，最终得26.5 g白色固体产物5，产率82.0%，熔点228～235℃（文献值：230℃）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ8.02（s，1H），7.99（s，1H），5.03（d，J=4.3 Hz，1H），4.09（d，J=9.3 Hz，1H），4.04～3.94（m，2H），1.06（d，J=5.6 Hz，3H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ157.17，149.03，145.75，141.39，124.15，65.20，50.86，21.26.ESI-MSm/z：194.3。

1.2.4 对甲苯磺酰基甲氧基亚磷酸（6）的合成称取50 g对甲苯磺酰基甲氧基亚磷酸二乙酯溶解于78 mL的乙腈中，加入40 g NaBr和42 g TMSCl，将混合物在60℃的油浴中加热3 h。原料消耗完毕后，过滤钠盐，减压脱去溶剂，残留物用50 mL蒸馏水洗涤，加水过程中可以观察到游离的白色固体，混合物常温下搅拌过夜（约12 h）。得到的反应液用正己烷洗涤，保留水相。得到的水相中加入50 mL的甲苯共沸干燥，最终得到无色或淡黄色的油状产物39.0 g，其产率为94.4%。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ7.37（m，J=16.5，7.8 Hz，2H），6.97～6.86（m，2H），3.28（m，J=53.8，14.4，8.3 Hz，3H），2.01（d，J=23.5 Hz，3H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ145.51，131.59，130.06，128.19，64.05（d，J=6.5 Hz），21.61。

1.2.5 替诺福韦（PMPA）的合成向500 mL三颈烧瓶中加入400 mL的DMF，并通过冰浴使溶液降温至0℃，在此温度下加入60 g叔丁醇钠和6 g氯化镁，此时溶液中有部分叔丁醇钠未完全溶解。待溶液内温降至0℃时，一次性加入20 g原料5，搅拌10 min，期间反应液温度保持在5℃以下。在1 h内分4次加入6（每次添加12 g），注意保持反应液温度不超过5℃，且不宜过快添加，避免溶液变得黏稠而搅拌困难。添加完毕后将反应液升温至室温（约20℃），过夜反应（约12 h）。原料被大部分消耗完毕后，停止反应，减压脱去溶剂，剩余固体用浓盐酸调节pH至2左右，期间有白色固体析出，使用冰浴将反应液降温至5℃以下。过滤白色固体，再用200 mL正己烷洗涤固体，得到的白色固体置于75℃下真空干燥。最终得到白色固体19.3 g，产率65.0%，熔点180～188℃（文献值：180℃）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ8.21（s，2H），7.13（s，2H），4.16～4.08（m，1H），4.02～3.98（m，1H），3.87～3.83（m，1H），3.81～3.69（m，2H），1.08（s，3H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ130.63，128.54，128.26，125.98，65.08，50.62，34.43，21.58，21.24.ESI-MSm/z：288.1。

2 结果与讨论

在合成2的过程中，使用原甲酸三甲酯或原甲酸三乙酯对最终产率影响不大，在两种原料市场价格相差不大的情况下，选择原甲酸三乙酯的原因在于反应副产物是乙醇，在绿色化学的要求下，相比于甲醇，生产更为安全，也容易处理。

从2到4的合成过程中，中间产物（3）不需要经过额外的分离，在不添加额外试剂的情况下，中间产物会缓慢成环生成4。加入额外的碱催化试剂（如碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钡等）会使得成环速率加快。日本Soda公司［15］使用氢氧化钠作为碱催化试剂，但是最终得到的产品聚合成黑油状，难以分离并且不能直接用于合成下一步。1990年，Proenc等［9］报道使用氢氧化钡作为碱催化剂，游离的钡离子与产物络合解聚，最终产品经过减压脱去溶剂呈浅灰色固体，后处理方式简单且方便继续做衍生化。采取此种方式，最终得到预期产品。

在合成5的过程中，溶剂应该选择极性非质子高沸点溶剂，水的存在会导致反应不佳，最终分离收率会降低，反应温度在80～120℃之间，过低的温度也会导致反应不佳，当反应内温高于120℃时，未能观察到产物的转化（结果如表1所示）。在后处理过程中，筛选了一些醇类溶剂，异丙醇表现出最好的分离效果。

表1 反应温度对分离收率的影响Tab.1 Effect of reaction temperature on isolation yield

在通过水解9合成6的过程中，通常使用路易斯酸作为水解试剂。Derstine等［11］报道使用TMSBr作为路易斯酸。2015年，Pizova等［16］报道了一种水解亚磷酸二乙酯的方法，作者使用TMSCl/NaBr体系水解。综合考虑原料的价格，选择TMSCl/NaBr水解体系，使得合成成本进一步降低。值得注意的是，6的纯度过低会影响5到PMPA的转化。

在合成PMPA的过程中，首先筛选了溶剂，溶剂的选择出于两方面考虑：一方面体系中的质子会消耗碱；另一方面，原料极性较大，小极性溶剂不能使原料有效溶解，从而导致5转化降低。因此考虑使用极性非质子溶剂，在此过程中尝试筛选1，4-二氧六环、乙腈、正己烷、DMF、NMP，其中DMF和NMP表现出更好的转换效果（结果如表2所示）。碱的选择是控制合成成本的关键因素之一，传统工业生产使用较为昂贵的叔丁醇镁，因此尝试使用叔丁醇钠，筛选了叔丁醇钠的物质的量作为对反应的转化影响因素，结果显示，5-7倍物质的量的叔丁醇钠有最好的转化效率，考虑到镁离子与6络合，会促进反应的转化，因此采用叔丁醇钠和氯化镁共催化的方法，结果表明更有利于PMPA的转化。温度的控制也是保证转化率的重要因素之一，在向反应液中添加原料6的过程中，若温度高于10℃，会导致反应液凝结而难以搅拌。另外，过快的滴加原料6，也会导致反应液凝结，最好的添加原料6的方式是在保持低温的前提下，缓慢滴加原料6的DMF溶液。

表2 反应溶剂对分离收率的影响Tab.2 Effect of reaction solvent on isolation yield

3 结论

PMPA的传统合成路线遇到的问题为：（1）以腺嘌呤为起始原料合成PMPA，在生成5过程中，不可避免的产生腺嘌呤上的N6-取代的烷基化副产物7。（2）从5到PMPA过程中，叔丁醇镁及三甲基溴硅烷等试剂的使用增加了合成路线的成本。考虑到上述问题，提出以下解决思路：（1）设计一种非核苷合成路线，避免使用腺嘌呤作为合成PMPA的起始原料。（2）考虑使用更廉价的碱、路易斯酸、溶剂等原料，从而控制合成成本。在已有的合成方法的基础上，本工作解决了传统工艺路线问题，合成PMPA的总收率从24%提升到37%；简化了后处理方式，同时使用更为经济的原料（如用叔丁醇钠替代叔丁醇镁、用TMSCl替代TMSBr等），进一步控制合成成本，适合工业生产。